实验三ELISA检测溶血素.ppt

实验三 ELISA检测溶血素,【试剂与器材】,绵羊红细胞（SRBC）免疫小鼠血清 抗SRBC阳性和阴性血清 辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗甲胎蛋白抗体 碳酸盐缓冲液（PH9.6） 磷酸盐缓冲液（PBS，PH7.4） 邻笨二胺液 硫酸（2M） 酶标反应板、微量加样器、温箱、冰箱、酶标仪等。,【试剂与器材】,包被稀释液（0.05mol/L Na2CO3NaHCO3 缓冲液，PH9.6） Na2CO3 1.5g NaHCO3 2.9g 加双蒸水至1000ml 封闭液（5%小牛血清/PBS 溶液） 小牛血清50ml PBS（PH7.4）950ml 洗涤液（PBST，PH7.4） NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO4.12H2O 2.9g KCl 0.2g Tween 20 0.5ml 加双蒸水至1000ml,【试剂与器材】,样本稀释液（PBS，PH7.4） NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO4.12H2O 2.9g KCl 0.2g 加双蒸水至1000ml 酶标第二抗体：羊抗人IgG 标记HRP（1：2000）,【试剂与器材】,底物液（OPDH2O2） A 液 （0.1mol/L 柠檬酸溶液） 柠檬酸19.2g 加双蒸水至1000ml B 液 （0.2mol/L Na2HPO4 溶液） Na2HPO4.12H2O 71.7g 加双蒸水1000ml 临用前取A 液24.3ml，B 液25.7ml 终止液（2mol/LH2SO4 溶液） 双蒸水600ml，浓硫酸100ml（缓慢滴加并不断搅拌），加双蒸水至900ml,【操作方法】,（1）包被酶标反应板 用pH9.6 的碳酸盐缓冲液1：200 稀释抗体，用之包被聚乙烯塑料板，每孔加0.2ml， 4C 1224h。 （2）封闭酶标反应板 弃掉包被液，用PBS 洗涤3 次，甩干后用5%小牛血清/PBS 液封闭。放37C40min（或4C 过夜）。封闭结束后用洗涤液洗板，并在滤纸上拍干，每孔洗3遍，每遍3min。,ELISA平板包被,间接法 抗原包被: 将包被液稀释的抗原（SRBC）BSA （2-10ug/ml）加入96孔酶标版中，每孔100ul，4C过夜。吸出上清液，加入封闭液200ul/孔。37C封闭1-1.5小时或4C过夜。封闭结束后用洗涤液洗板3次，每次3分钟。,【操作方法】,（3）按图1-11 所示加入待测样品及阳性对照（用PBS 稀释） 将稀释好的待测血清样品加入酶标反应板中，每孔0.2ml，阳性对照样品亦相应稀释。置于37C 温箱0.51h。弃去孔中液体，用洗涤液洗涤3 遍，每遍3min。 （4）加酶标二抗 （用PBS 稀释） 加入辣根过氧化物酶标记的抗甲胎蛋抗体，每孔0.2ml 置于37C 温箱，3045 min。弃去孔中液体，拍干，每孔洗涤3 遍，每遍3min。,【操作方法】,（5）加入底物液 取底物液：A 液24.3ml，B 液25.7ml，加双蒸水50ml 得pH5.0 的磷酸枸缘酸缓冲液100ml。再加入邻苯二胺40mg，充分溶解，最后加入30% H2O2 0.15ml。每孔加入底物液100l。避光室温作用510min。 （6）终止反应 当阳性对照出现明显颜色变化后，每孔加入终止液50l 终止反应。,【结果分析】,目测：根据显色深浅，用（-）为无色，（+）为浅色，（+）为黄色，（+ + +）为棕黄色表示。一般呈+ +以上者为阳性 酶标仪测定：在492nm 波长下测OD 值（A492） 。 当待测样品A492值与阴性对照A492值的比值（P/N）大于2.1时，或待测样品A492对照A492值 +3s，即可判断为阳性。以最大显色至阳性显色孔的50%反应孔的抗体稀释倍数为抗体效价。,x,【注意事项】,1.封闭时注意将封闭液加满各反应