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第二章 基因工程工具酶,分类： 限制性内切酶（Restriction Endonuclease） RNaseA 1.水解酶类 核酸酶 RNaseT1 RNaseH DNase S1 核酸外切酶（Exonuclease）,大肠杆菌DNA聚合酶 （DNA Pol ) 大肠杆菌DNA聚合酶大片段 （Klenow Fragment|） 2.DNA聚合酶类 嗜热DNA聚合酶（Taq酶 ） DNA连接酶 ( Ligase ) 反转录酶（Reverse Transcriptase),小牛肠碱性磷酸酶(CIP) 3.修饰酶类 细菌碱性磷酸酶(BAP ) T4噬菌体多核苷酸激酶 （T4 Phage Polynucleotide Kinase),鼠源 禽源,（一）限制性核酸内切酶的发现 （二）限制性核酸内切酶的分类 （三）限制性核酸内切酶的命名 （四） II型限制性核酸内切酶的基本特性 （五）限制性核酸内切酶的消化反应条件,一、 限制性核酸内切酶,由寄主控制的限制和修饰现象-20世纪60年代，Linn和Arber 发现,(K),大肠杆菌B,大肠杆菌K,EOP=1,EOP=1,EOP=10 -4,EOP=10 - 4,EOP 成斑率 efficiency of plating,外源DNA,自身DNA,（一）核酸限制性核酸内切酶的发现,限制和修饰现象,限制修饰的酶学系统,酶切位点 不被修饰,噬菌体DNA 被切割,酶切位点 被修饰,基因组DNA 不被切割,E.coli B含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶 当(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。,1962年瑞士的W.Arber（阿尔伯）提出细菌的限 制修饰系统。1968年发现型内切酶; 1968年美国的H. O. Smith发现型内切酶; 1970年美国的O. Nathans（内申斯）用型酶制备了肿瘤基因; 1978年三人共获诺贝尔生理与医学奖。,从此，相关研究展开。目前已纯化出3000种限制性内切酶中，其中有30%是在NEB发现的 。 概念: 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ） 一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3,5-磷酸二酯键。,（二）限制性核酸内切酶的类型及其主要特性,特性 1. 限制修饰活性 2. 内切酶的蛋白 质结构 3. 限制辅助因子 4. 切割位点 5. 特异性切割 6. 基因克隆中,I 型 双功能的酶 3种不同亚基 ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸 距特异性位点5端至少1000bp 不是（随机） 无用,II 型 限制酶和修饰酶分开 单一成分 Mg2+ 位于识别位点上 是 非常有用,III 型 双功能酶 2种亚基 ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸 特异性位点3端24-26bp处 是 用处不大,（三）限制性核酸内切酶的命名,1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体 字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichia coli 表示为Eco , 流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为 Hin； 2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind； 3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则 用罗马数字标出，比如Eco R I、 Hind III。,EcoR （酶名称）: Escherichia Coli Rnis 属名 种名 株系 编号,（四）II型限制性核酸内切酶的基本特点,1、识别位点的特异性 每种酶都有其特定的DNA识别 位点，通常是由48个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。 2、识别序列的对称性 靶序列通常具有双重旋转对称 的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。 3、切割位点的规范性 交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。,能识别外源DNA并将其水解的内切核酸酶，是细菌对外源DNA的防御机制。,几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点,与II型核酸内切酶有关的几个概念,粘性末端 cohesive ends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。 平 末 端 Blunt end在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。 同裂酶 isoschizomers 能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源的内切酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。 同尾酶 isocaudamers 识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。如BamH I 、BclI、BglII和 Xho I 是一组同尾酶。,平齐末端,带5P端的黏性末端,带3OH 和5P端的平末端,例如Hpa和Msp是同裂酶，识别顺序都是 5C|CG G3 3G GC|C5 如果其中有5-甲基胞嘧啶，Hpa不能够切割，MspI能切割。,同裂酶切割DNA时，产生相同的粘末端，故被切割得DNA可重组并且重组后产生两种情况A.B,如图： MobI BamHI BglII 5NGATCN3 5NGGATCCN3 5NAGATCTN3 3NCTAGN5 3NCCTAGGN5 3NTCAAGAN5 5N GATCCN3 5NG GATCTN3 3NCTAG GN5 3NCCTAG AN5 5NGATCCN3 5NGCATCTN3 CTAGGN5 CGTAGAN5 A: 可被MobI识别切割，但不被 B:重组DNA,-不能被上述酶识别 BamHI识别切割。 与切割。,注意,限制性内切酶对外源DNA的作用无种属特一性：对不同的外援DNA,只要有酶的识别顺序即可切割DNA产生相同的粘末端或平截末端，据此可进行DNA的重组。 在A情况下产生的重组体只能被一种酶消化，减少了可逆反应，提高了重组率。转化后还可以用可消化的那种酶(Mob)进行酶切鉴定。 在B情况下，产生重组体。不能再被两种酶识别，消除了可逆反应，效率更高。但转化后不能再用这两种酶鉴定。通常选A的情况。,4. 不具有甲基化功能 II型限制性核酸内切酶的甲基化修饰作用由相应的甲基化酶承担。 5. 对单链DNA的切割 切割效率较低。,酶活单位 一个限制酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37）下，1h内中完全降解1 g DNA所需要的酶量。,（五）限制性核酸内切酶的消化反应,酶 切 反 应 的 基 本 步 骤,电泳,紫外分析,37 1h,加反应液,CK,M,Buffer (10) 2.0 L ddH2O 约16.5 L DNA 0.21.0 g Enzyme 12U Volume 20.0 L,1.0kb,1.0kb,0.4kb,0.5kb,0.6kb,CK,M,T,T,反应 体系,混匀,最适温度,酶量,时间,反应终止,电泳鉴定结果,在“非最适的”反应条件下,有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象叫星号活性，用*表示。 限制性内切酶的第二活力 （Secondary activity，又称星号活力） 指改变了酶的反应条件，使酶原有的识别特异性的降低。 例如：EcoRI的典型特异性是核苷酸序列GAATTC，当改变此酶的反应条件时，他的特异性由原来的6核苷酸降低为四核苷酸AATT。,星号活力的产生可为酶提供新的序列特异性，这些活性在某些情况下可能是有用的，但是很少导致第二识别位点的完全或同等的切割，因此为了避免星活力的出现，所有限制性酶切反应均应在标准条件下，通常反应条件通过缓冲液控制。,（六）影响限制性核酸内切酶活性的因素,影响酶活性的因素很多，最重要的有： 酶纯度 DNA的纯度 DNA的甲基化程度 酶切反应的温度与时间 DNA的分子结构 限制性核酸内切酶的缓冲液,（1）酶纯度 引起某些酶活力变化的因素较多，包括甘油的浓度，离子的浓度，PH值，有机溶剂的存在，二价阳离子过高的酶和DNA浓度的比例。 （2）DNA纯度 铂，酚 ，氯仿，酒精，EDTA，SDS，盐离子等均影响酶活性。 纯度不高，含有蛋白，特别是DNase加入Buffer时因有Mg2+ ，而激活降解DNA样品，而无特异带。 解决办法：扩大反应体积 20L50L 延长酶作用时间 1h数小时 增加酶用量 1u10u,（3）DNA甲基化程度 甲基化程度高不被大多数限制性内切酶切割，解决办法是： 选用无甲基化酶的突变菌株； 使用对甲基化酶碱基无切割能力的酶（对哺乳动物DNA）。,（4）酶切反应的温度与时间 所有限制性内切酶均应在标准条件下进行，大多数最适反应温度是37，少数耐热 Taq是65；Sma 是25 （30 ）。反应时间与酶量有关。 （5）DNA分子的构型 不同构型的影响很大：消化超螺旋环状DNA用的酶量大于线性DNA 不同位点切割能力不同 （6）限制性核酸内切酶的反应缓冲液 Mg2+，Tris-HCl，NaCl或KCl -巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)(防止酶氧化,以保持活性) BSA（牛血清白蛋白）稳定酶蛋白。,（七）其它水解核酸的酶 1. 水解RNA的核酸酶(Rnase):种类很多介绍五种 酶名称 来源 最适PH 作用特点 反应式 应用 RNaseA 胰脏 7.9 切嘧啶产生 ApUpCpNp RNA测序 3p嘧啶核苷 酸或以其结 ApUp+Cp+Np 尾的寡核苷酸 RNaseT1 米曲霉 4.5 切G产生3Gp GpGpApCpGp 同上 或以其为结尾 的寡核苷酸 Gp+Gp+ApCpGp RNaseU2黑曲霉 4.5 切A产生3AP GpApCpApAp 同上 或以其结尾的 寡核苷酸片段 GpAp+CpAp+Ap RNasephy头绒孢菌 不切C产生3Ap, GpApCpUpGp 同上 3Gp,3Up或以其 为结尾片段 GpApCpUpGp,RNaseH 大肠杆菌 水解DNA-RNA杂交 分子中的RNA,2 核酸酶S 来自稻谷曲霉 高度特异性于单链核酸的内切酶：可催化单链RNA或DNA，降解成5单核苷酸。同时也可作用于双链核酸分子的单链区（小到一个碱基）。 作用： 测定杂交分子（DNA-DNA)或(RNA-DNA)的杂交程度，即使是一对碱基没杂交也能检测到。 cDNA合成时去掉第一连与第二连的发夹结构 测定DNA上内含子的位置,（一）DNA连接酶的概念与作用机制 （二） 连接酶种类及特性的比较 （三） DNA连接酶作用的特点 （四） DNA连接酶的反应条件 （五）影响连接反应的因素DNA连接的策略 （六）T4 DNA连接酶对目的DNA片段和 载体连接的一般方案,二、 DNA连接酶及其应用,DNA重组的核心技术：DNA片段之间的体外连接 连接酶。,（一）DNA连接酶的概念与作用机制,环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种切口的酶存在。 首个DNA连接酶(ligase)1967年，大肠杆菌DNA连接酶，是大肠杆菌基因编码 。 1970年，发现了T4DNA连接酶 ， 由大肠杆菌T4噬菌体基因编码的。 概念： DNA连接酶（Ligase） 能够催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶。,DNA连接酶的催化反应 DNA ligase + NAD+/ATP 酶-AMP复合物 +DNA AMP-DNA 相邻3-OH对活化的磷原子发生亲核攻击 AMP 3,5-磷酸二酯键,DNA 连接酶连接的作用机制,（二）连接酶种类及特性的比较,最常用,（三）DNA连接酶作用的特点,A. 连接的两条链必须分别具有自由3-OH和5-P，而且这两个基团彼此相邻； B. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。,E.coli DNA连接酶 连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），现在研究可连接平末端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。 T4DNA连接酶连接具互补碱基黏性末端和平末端， 需ATP辅助因子，活性高，常用。,是双链因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。 OH P 是相邻的因此不能封闭gap，只能封闭nick.,gap NO,Nick OK,（四）T4 DNA连接酶连接反应的条件,连接酶反应体系,连接液灭活后最好立即转化或储存于4-8，时间不要太长，会降低转化率。,DNA末端的浓度 较高浓度的DNA，利于分子间连接，形成线性二聚体或多聚体分子。 温度（通常在4-16 ） ATP的浓度(10molL 1molL ) 连接酶浓度（一般平末端大约需12U，粘末端仅需0.1U） 反应时间（通常连接过夜） 插入片段和载体片段的摩尔比（ 1151）,（五）影响连接反应的因素,（六）T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案,1连接反应一般在灭菌的0.2-0.5ml离心管中进行。 210l体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1151），补足ddH2O 至8l。 3轻轻混匀，稍加离心，56水浴5min后，迅速转入冰浴。 4加入含ATP的10Buffer 1l，T4 DNA连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10l，稍加离心，在适当温度（一般14-16）连接8-14hr。,粘性末端DNA片段的连接DNA连接酶连接法,Nick,Nick,平末端DNA片段的连接末端同聚物加尾法,3,3,5,5,3,3,5,5,DNA聚合酶和 T4DNA连接酶,平末端DNA片段的连接衔接物连接法,衔接物(linker)，也叫接头，是有人工化学合成的一段10-12个核苷酸组成，具有有1个或几个限制性酶切位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。,GGATCC CCTAGG,+,BamHI切割,GATCC G,连接酶经BamHI切割的pBR322,G CCTAG,BamHI衔接物,dsDNA,GGATCC CCTAGG,GGATCC CCTAGG,连接酶,重组DNA分子,GATCC G,G CCTAG,如何避免单酶切后产生的相同的粘末端或平末端的自身环化？,（一）大肠杆菌DNA聚合酶I （二）Klenow片段酶 （三）T4 DNA聚合酶 （四）逆转录酶（反转录酶）,三、DNA聚合酶及其应用,（一） 大肠杆菌DNA聚合酶I （E.Coli DNA pol I） 是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌E。Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括 3种不同的酶活力： 5- 3聚合酶活性 （模板， 带3OH游离基团的引物、4dNTPs、 Mg2+ ） 双链特异性的53核酸外切酶活性 35核酸外切酶活性。 从游离的双链或单链DNA的3端降解。不过对于双链的降解可被5-3的多聚活性所抑制。主要是校正作用。,CCG GGCTATCGGA,A,T,A,G,CCT,CCGATAGCCT GGCTATCGGA,CCGATAGCCT GGCTA,T,大肠杆菌DNA聚合酶I 的三种用途,A. 利用缺口转移法制备高比活度的DNA探针 利用其53的外切酶活性及其聚合酶活性。 B. 用于DNA连接前的大缺口填充 利用5 3的聚合酶活性。 C. 用于DNA的序列分析 利用5 3的聚合酶活性。,大肠杆菌聚合酶I的应用示例,缺口平移法制备探针,Pol I + Mg2+32P dNTPs,（二） Klenow片段酶,Klenow片段是大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，分子量为76KD 。 酶催活性：5 3 的聚合酶活性 3 5 的核酸外切酶活性,CCGATAGCCT GGCTA,Klenow片段的主要用途（利用5 3 的聚合酶活性） 修补限制性酶消化DNA形成的3隐蔽末端 标记DNA片段的末端 底物用32PdNTPs cDNA克隆中第二链cDNA的合成 DNA序列的测定,（三） T4DNA聚合酶,T4DNA聚合酶是 从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的， 酶催活性： 53的聚合酶活性 3 5 的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶 I 的活性高200倍。比Klenow 片段酶强1001,000倍。 因此，可以综合利用这两种活性进行取代合成反应： 如果反应体系中仅存在一种dNTP或没有底物时，这时T4DNA聚合酶就会表现出3 5 外切酶活力，从双链DNA的3开始降解，直到露出底物dNTP相同的碱基。然后就在此位置发生合成和取代反应。,CGTCGC GCAGCG,CGTCGC GCAGCG,dTTP,Mg+,CGT GCAGCG,32P dNTPs,Mg+,T4DNA聚合酶的用途,1、利用取代合成反应制备探针 2、标记具有平末端的或具有3隐蔽末端的DNA片段 利用较强的3 5 外切酶活性和 53聚合活性 3、用于DNA序列分析双脱氧终止法对长片段DNA进行测序的理想用酶。,（四） 逆转录酶Reverse transcriptase,逆转录酶 是一种依赖RNA的DNA聚合酶。 1970年H.M.Temin（美）和D.Baltimore(美)同时分别从禽成髓细胞瘤病毒和鼠白血病病毒中发现了AMV RT和Mo-MLV RT , 1975年二人共获诺贝尔生理医学奖。 目前两个酶已经商品化生产。 功能：多功能酶，主要有三种酶活性： 依赖于RNA的DNA聚合酶功能。 RNaseH功能：水解DNA-RNA杂交分子 中的RNA链。 依赖于DNA的DNA聚合酶功能。,AMV-RT与Mo-RT在结构、作用特点上不完全相同，在cDNA文库构建中讲述。,oligo(dT),5 3 DNA链,3 5,RNA,E活性1 4dNTP,3 5,RNA链 DNA链,RNaseH (活性2),E(活性3） 4dNTP,3 ds-DNA 5,5 3,3 ds-DNA 5,5 3,SI核酸酶,（一）末端转移酶（terminal transferase） （二） SI核酸酶（SI nuclease） （三）碱性磷酸酶,四、修饰性工具酶,（一）末端转移酶,末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的DNA