基因工程基础知识与基本技术概述.ppt

1,第一章 基因工程基础知识与基本技术,2,1.1 基因工程的基础知识,1.1.1 基因的结构特点,基因按照它们在细胞内分布的部位，又可分为胞核基因和核外基因。胞核基因存在于细胞核内，位于染色体上；核外基因分散在细胞质内，又称胞质基因(真核细胞的细胞器基因)。,3,原核生物基因结构特点,大多数原核细胞中，只有一个DNA分子，即一条染色体。原核细胞基因组DNA的绝大部分可编码蛋白质，其中只有极小部分不转录，即非编码区。 在原核细胞中，功能相关的结构基因相互串联排列，受上游共同调控区的控制，同时转录，同时翻译，最终形成功能相关的几种蛋白质。,4,41-44bp, 原核生物启动子结构,Pribnow,原核生物基因启动子相关的保守核苷酸序列 Pribnow框或-10区： -4 -13bp之间由个核苷酸组成，多数是TATAA序列。 -35区：-35bp前后保守的TTGACA序列。,5,原核生物DNA特点归纳:,绝大多数的原核生物DNA分子都会发生转录和翻译。 原核生物基因中，编码具有相关功能的RNA或蛋白质的，能串连在一起，集中于基因组的特定部位，共同形成某些功能或转录单元。 原核生物基因具有重叠基因。,6,原核生物mRNA特点:,半衰期短。 多顺反子形式。 存在序列。,7,原核生物基因终止子特点:,终止子，就是提供转录终止信号的这样一段 DNA序列。 终止子上游存在一个富含碱基的二重对称区。 终止点上游有段个碱基构成的保序列。,终止子发夹结构序列,8,基因不连续性。 内含子。 外显子。 卫星。,真核生物基因结构特点,9,真核生物基因的不连续性,10,真核生物基因的内含子,DNA上的内含子会被转录到前体RNA中，但RNA上的内含子会在RNA离开细胞核进行转译前被剪除。在成熟mRNA被保留下来的基因部分被称为外显子。真核生物的基因含有外显子和内含子，是前者区别原核生物的特征之一。,11,真核生物基因的连接区,内含子和外显子接头的处，往往会存在的高度保守的特异性碱基序列 。,12,垃圾,13,真核生物基因的外显子,外显子，它是真核生物基因的一部分，它在剪接后，仍然会被保存下来，并且可以在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。,14,真核生物基因的侧翼序列,15,真核生物基因的卫星,卫星DNA，主要指的是真核细胞染色体中，一些具有高度重复核苷酸序列的，同时碱基数又非常少一般只有20-30bp左右的DNA片段。,16,1.1.2 从到蛋白质,17,基因表达,基因表达，其实指的就是生物细胞在生命过程中，把储存在DNA序列中的遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子过程。,转录水平表达 翻译水平表达,18,转录水平表达,转录水平的基因表达，就是在RNA聚合酶的催化下，以DNA为模板，合成mRNA的过程。这个过程，也就是转录过程。,参与转录的物质,原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板:DNA 酶: RNA聚合酶 其他蛋白质因子,RNA合成方向：5 3,真核生物基因转录，它会有如剪接，加帽，加尾等等过程。,19,在5端加帽,5端的一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸（m7Gppp）。mRNA5端的这种结构称为帽子（cap）。,帽子结构功能： 能被核糖体小亚基识别，促使mRNA和核糖体的结合； m7Gppp结构能有效地封闭mRNA 5末端，以保护mRNA免受5核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定。,20,3端加尾,Poly(A)尾，主要的功能是：有助mRNA从核到细胞质转运；避免在细胞中受到核酶降解，增强mRNA的稳定性。,21,蛋白质翻译,氨基酸的活化 翻译的起始 肽链的延伸 肽链的终止 蛋白质前体的加工,主要过程,22,蛋白质前体的加工,1、N端fMet或Met的切除 2、二硫键的形成 两个半胱氨酸-SH 二硫键 3、特定氨基酸的修饰 磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化和羧基化 4、切除新生肽链中非功能片段,23,操纵子学说,操纵子， 是基因转录的功能单位。操纵子概念的提出，表明人们已认识到基因的功能并不是固定不变的，而是可以根据环境的变化进行调节。,24,乳糖操纵子学说内容,-半乳糖苷酶、-半乳糖通透酶、以及-半乳糖苷乙转移酶基因产物由同一条多顺反子的删A分子所编码 这个mRNA分子的启动子区P紧接着操作子区O而位于阻遏子区I与操作子区0之间的启动子区(P)，不能单独起动合成-半乳糖通透酶和透过酶的过程 操作子是乳糖操纵于DNA上的一小段序列，仅为26bp是阻遏物的结合位点 当阻遏物与操作子结合时，lacmRNA的转录起始受到抑制 诱导物通过与阻遗物结合，改变它的三维构像，使之不能与操作子结合从而激发lacmRNA的合成。,25,操纵子调节类型,代谢产物对基因活性的调节 降解物对基因活性的调节 环腺苷酸受体蛋白对转录的调节,26,1.1.3基因研究进展,遗传密码子与信息流 遗传密码是一组规则的，将DNA或RNA序列以三个核苷酸为一组的密码子转译为蛋白质的氨基酸序列。,尼伦伯格,27,管家基因和奢侈基因,管家基因，也称持家基因，是指特定物种所有细胞中均要表达的一类基因，而且这种基因的表达产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。 奢侈基因是指只在特别细胞类型中大量表达并编码特殊功能产物的这样一种基因。,28,移动基因,转座子是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列（IS）。,转座子引起的插入突变,29,指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上基因的组成部分。重叠基因有多种重叠方式。,重叠基因,假基因,假基因它是具有与功能基因相似的序列，但是由于有许多突变以致失去了原有的功能，,假基因特点:基因的结构发生突变；没有内含子；具有与mRNA的poly(A)尾的相应结构；两侧有顺向重复序列；随机出现在非正常的位置上。,30,单倍体细胞中的全套染色体为一个基因组，或是单倍体细胞中的全部基因为一个基因组。基因组应该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。,基因组,有的物种，较为复杂一些，可能含有多套基因组，如：植物的核基因组；线粒体基因组；叶绿体基因组等。,31,(1)原核生物基因组的特点 具有操纵子结构；编码序列在基因组中约占50，远大于真核基因组，但又小于病毒基因组；多顺反子结构且无内含子，是连续的Pg此转录后不需要剪切；基因组中重复序列很少；基因组中存在可移动的DNA序列，包括插入序列和转座子。 (2)真核生物基因组的特点 每一种真核生物都有一定的染色体数目；真核生物的莱因织远远大于原核生物的基因组，结构复杂，基因数庞大，具有很多复制起点，每个复制子大小不一；真核生物都有结构基因与相关的调控区组成，转录产物为单顺反于，即一分子mRN只能翻译成一种蛋白；大量重复顺序的存在是真核生物基因组的重要特点；真核生物基因组内非编码的顺序占90以卜，基因组中的非编码的顺序所占比例是真核生物与细菌、病毒的重要区别，正在一定程度上也是生物进化的标尺；大多数真核生物的结构基因具有内含子结构，是断裂基因，而原核生物基因不含内含子序列；有基因家族，来自同一个祖先基因的复制和变异、功能相关的基因构成各种基因家族，可以串联在一起，亦可相距很远，。,原核与真核生物基因组特点,32,电泳技术 技术 分子杂交技术 序列分析技术 基因突变技术,1. 基因工程的基本技术,33,电泳，指混悬于溶液中的样品电荷颗粒,在电场影响下向着与自身带相反电荷的电极移动的现象。,1.2.1 电泳技术,琼脂糖电泳 聚丙烯酰胺电泳,34,琼脂糖电泳，就是用琼脂糖凝胶作支持物的电泳方法。,琼脂糖电泳,35,琼脂糖电泳的操作,正确选择凝胶浓度 适合的电泳缓冲液 电泳的合适电压和温度 DNA样品的纯度和状态 DNA的上样 Marker的选择 凝胶的染色和观察,36,使用聚丙烯酰胺凝胶作为基质,进行电泳的方法。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,非变性聚丙烯酰胺凝胶 SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）,37,SDS-PAGE电泳,SDS-PAGE电泳 ，中SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。,38,1.2.2 PCR技术,PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。,39,PCR技术的发现,1984年11月15日，PCR实验获得了成功 1985年3月28日，申请有关PCR的第一个专利 1985年9月20日，一篇关于PCR应用的文章关交科学杂志，11月15日接受发表。 1985年12月，一篇正式介绍PCR的原理的论文送到自然杂志，拒稿。后改投吴瑞为主编的酶学方法杂志。 1986年5月，穆利斯去冷泉港实验室举行的“人类分子生物学”专题研讨会上介绍PCR技术 1991年12月12日，霍夫曼拉夫什公司出资3亿美元购买PCR技术。西斯特公司倒闭 1993年10月13日，穆利斯因发明PCR技术获诺贝尔化学奖。,40,技术实验过程,PCR实验原理图,41,反应的特点,特异性强 灵敏度高 能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板，扩增到微克(g=10-6)水平 简便、快速 一般在24 小时完成扩增反应,引物与模板DNA特异正确结合； PCR反应遵循碱基配对原则； Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性。,42,PCR的整个反应体系,模板 (基因组DNA、mRNA 、 cDNA 、质粒等) 引物 底物dNTP ； 耐热DNA聚合酶 PCR缓冲液 氯化镁 水 (ddH2O),43,PCR技术的扩展,不对称PCR 逆转录PCR 锚定PCR 反向PCR 随机引物PCR 差异显示RTPCR 单链构象多态性PCR,44,锚定PCR,锚定PCR示意图,45,反向PCR,反向PCR示意图,46,巢式PCR,47,1.2.3 分子杂交技术,分子杂交:不同来源或不同种类生物分子间相互特异识别而发生的结合。如核酸(DNA、RNA)之间、蛋白质分子之间、核酸与蛋白质分子之间、以及自组装单分子膜之间的特异性结合。,核酸分子杂交，就是由来源不同的两个脱氧核糖核酸单链或核糖核酸单链结合成双链分子的这样一个过程。,48,核酸分子杂交,杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总DNA或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。 探针必须经过标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。,49,核酸分子杂交主要内容,核酸分子变性 核酸分子复性 核酸分子杂交,50,核酸分子杂交操作过程,转移。 固定 杂交 漂洗,51,分子杂交具体类型,southern杂交 northern杂交 western杂交,southern杂交示意图,52,northern杂交示意图,53,1.2.4 DNA序列分析,DNA序列分析技术主要由三部分组成： 产生具有不同长度的DNA片段。这些长度之间的最小差异是一个核苷酸且被特定的标记化合物标记，便于其后的检测； 在变性的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，变性胶的分辨率为一个核苷酸； D