体细胞免疫治疗联合肿瘤常规治疗的基本原则(一)

体细胞免疫治疗联合肿瘤常规治疗的基本原则,中山大学肿瘤防治中心 夏建川,一、肿瘤体细胞免疫治疗,向肿瘤患者输入具有抗肿瘤活性的免疫细胞（包括特异性或非特异性），直接杀伤肿瘤细胞或激发机体抗肿瘤免疫反应，从而达到治疗肿瘤的目的，这一过程称为体细胞免疫治疗。 大量研究表明，肿瘤患者的外周血中存在癌细胞，是引发肿瘤复发转移、导致患者死亡的重要原因之一。有效清除血循环中的癌细胞，对抑制肿瘤的复发和转移，改善肿瘤晚期患者的生存质量具有重要的作用。,体细胞免疫治疗的过程,（一）自体树突状细胞疫苗（DC 细胞）； （二）自体细胞因子诱导的杀伤细胞 （CIK 细胞）； （三）自体树突状细胞（DC）刺激CIK细胞（DC-CIK 细胞） （四）自体自然杀伤细胞（NK 细胞）； （五）经基因修饰的自体DC细胞激活T淋巴细胞（DC-T细胞） （六）自体链式CIK巴细胞（Capri 细胞）,目前临床上常用几种体细胞免疫治疗,（一）树突状细胞疫苗,DC 是人体内功能最强大的抗原提呈细胞，通过对肿瘤抗原的摄取及抗原提呈，可有效地诱导及活化免疫效应细胞，从而产生强大的抗肿瘤特异性免疫。,Immature Dendritic Cell (Periphery),Mature Dendritic Cell (Lymphoid),Antigen capture and processing,树突状细胞激刺激T淋巴细胞 转化成效应细胞,几种DC肿瘤疫苗制备流程,如何获得高纯度的肿瘤抗原？,树突状细胞在抗肿瘤免疫中发挥重要作用,2010.4.29 美国食品药品管理局批准 Provenge (sipuleucel-T)，作为一种治疗晚期前列腺癌患者的免疫活性细胞，这标志着癌症进入一种新的治疗：自身免疫活性细胞治疗。 Provenge诱导作用是通过抗原提呈细胞(APCs)负载前列腺癌酸性磷酸酶（PAP）抗原，继而激活肿瘤特异的CD8+T细胞，诱导抗前列腺癌免疫应答。这是FDA首次批准的自体免疫细胞用于治疗肿瘤。,发病率高,病情进展 缓慢,肿瘤相关 抗原表达,化疗疗效 有限,“非必需” 组织,前列腺癌细胞免疫治疗获得成功的原因,PSA、PAP等,内分泌治疗无效的患者，此时肿瘤负荷较小，机体具有一定的抗肿瘤能力,Nat Rev Immunol. 2010, 10: 580-593.,Provenge疫苗治疗晚期前列腺癌的机制,受试者：512名 总体生存期：对照组 21.7个月，治疗组25.8个月。 3年存活率： 治疗组 32% ，对照组只有23%。 副作用：主要是发烧、发冷、疲劳和疼痛。,治疗结果,2011年诺贝尔生理学或医学奖,Bruce A. Beutler Jules A. Hoffmann Ralph M. Steinman,2011年诺贝尔生理学或医学奖揭晓，美国、法国三位科学家因在免疫学方面的发现获奖。其中一半的奖金归于Bruce A. Beutler和Jules A. Hoffmann，获奖理由是在“Toll样受体和先天免疫激活方面的发现”；另一半奖金归于Ralph M. Steinman，获奖理由是“发现树突状细胞及其在获得性免疫中的作用”。 美籍科学家比尤特勒和卢森堡籍科学家霍夫曼是因为发现“Toll样受体（Toll-like Receptors，TLRs）及其配体”获得2011年诺贝尔生理学或医学奖,DC疫苗的制备,抽取骨髓30ml BMDC,GM-CSF, IL-4, TNF,成熟的DC,培养68 days,TNF, IL-4 GM-CSF,加肿瘤抗原,抽病人60ml-80ml外周血（或上血细胞分离机）,树突状细胞疫苗在实体瘤 治疗中的策略（1）,从外周血或骨髓中分离单个核细胞，体外诱导DC细胞,负载肿瘤抗原的DC细胞，通过静脉回输给病人或经皮下注射（至少8次）,经肿瘤抗原负载DC细胞能刺激自体T细胞,产生强烈的抗肿瘤免疫应答。,常规治疗尽可能使肿瘤负荷降低,树突状细胞疫苗在实体瘤 治疗中的策略（2）,负载肿瘤抗原的成熟DC与自体的淋巴细胞混合，刺激自体T细胞产生细胞毒性T淋巴细胞,将这些细胞毒性T淋巴细胞通过静脉回输给病人（至少4次）,直接杀伤肿瘤肿瘤细胞,常规治疗尽可能使肿瘤负荷降低,从外周血或骨髓中分离单个核细胞，体外诱导DC细胞,从手术后肾癌组织中分离纯化肾癌细胞,未纯化的人肾癌细胞,纯化后的肾癌细胞,贴壁生长的肾癌细胞,（六）链式CIK细胞的制备,激活的淋巴细胞,淋巴细胞,自体链式CIK细胞（CAPRI 细胞）,PBMNC （80-100ml外周血 或上血细胞分离机）,共培养,细胞激活因子1,第一次激活,细胞激活因子2,第二次激活,细胞激活因子3,负载CEA 抗原的DC刺激的T淋巴细胞的表型,一些抗原与肿瘤的发生发展密切相关,Viral antigens: Primary hepatic carcinoma: Hepatitis B virus, Hepatitis C virus Cervical cancer : Human papillomavirus: E6, E7. 2. Self-antigens: Lung cancer: k19, Her-2/neu, etc. Primary hepatic carcinoma: -FP. Breast cancer: Her-2/neu, BA46, etc. Prostate cancer: PSA, PSMA,PAP,自体DC-T淋巴细胞在恶性肿瘤 治疗中的策略,体外诱导DC-T淋巴细胞,回输DC-T淋巴细胞给的患者（两周一次，至少4次）,特异性杀伤肿瘤细胞,抑制肿瘤的复发和转移,常规治疗尽可能使肿瘤负荷降低,前列腺癌,患者，男，年龄：68岁 2007年4月，常规体检时，发现PSA显著升高，100ng/L穿刺活检提示：前列腺癌，Gleason评分：10分。胸部CT: 未见异常。 行内分泌治疗：诺雷德 Zoladex（goserelin）+康士得/Casodex （Bicalutamide）。PSA迅速下降，9个月后降至0.2以下，继续维持9个月后，选择了间断治疗（停用这两种药物），PSA迅速上升，6个月后升至16，继续内分泌治疗，PSA迅速降至0.16，以后就逐步上升，倍增时间1416周。自2010年9月开始出现全身骨痛，以左髋部明显，胸腹部CT：椎体及髂骨广泛转移灶， 全身骨扫描：中轴骨广泛转移。左髋臼及多处肋骨转移。 2011.2-13: PSA: 1376 ng/ml ， 2011.3-28开始进行生物治疗，回输两次DCT，2011.4.25 PSA: 737 ng/ml，2011.5.25回输四次DCT（负载PSA抗原的DC刺激的自体T淋巴细胞）,一星期后检测 PSA 561 ng/ml。现在患者感觉精神改善，无明显副反应。生活能够完全自理，能够自由下床活动，左髋部不适改善，疼痛不明显，无需止痛药物。饮食可，精神可。,DCT 细胞免疫治疗,用负载前列腺癌细胞高表达抗原PSA和PSMA负载自体DC刺激的自体T淋巴细胞对前列腺癌患者治疗后，外周血中PSA水平明显下降,PSA: 1376 ng/ml,PSA 561 ng/ml,（三）CIK细胞治疗肿瘤,“CIK细胞” 是将人的外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子（如抗CD3McAb, IL-2, IFN-, IL-1等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。 在这群细胞中，CD3+CD56+细胞被证明是CIK细胞群中的主要效应细胞，这群细胞兼具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特性，在临床上具有强大的广谱抗瘤活性。,自体CIK细胞的制备,PBMNC 0.5-3107（抽患者50-60ml 外周血）,24 个175cm的培养瓶,IFN Il-2 CD3 mAb IL 1,12-14 days 11.51010,经淋巴细胞亚群检测，CIK细胞的中CD3CD56双阳性细胞的数量达到42.35%，,CIK细胞杀伤肿瘤细胞机制,（四）自体DC细胞激活的CIK细胞,通过体外诱导有活性的自体DC细胞，将这种DC细胞与自体CIK细胞共培养，产生一种的抗肿瘤的免疫效应细胞（DC-CIK细胞），研究表明，DC-CIK细胞能大量促进INF-的分泌，提高细胞毒性，增强对肿瘤细胞的杀伤作用。,自体DC-CIK 细胞的制备,CIK细胞,成熟DC细胞,DC细胞刺激的CIK细胞（ 11.51010 ）,PBMNC 0.5-3107（抽患者50-60ml外周血）,共培养,TNF, IL-4 GM-CSF,IFN Il-2 CD3 mAb IL 1,DC刺激的自体CIK细胞的表型,自体CIK、DC-CIK在临床肿瘤 治疗中的策略,常规治疗尽可能使肿瘤负荷降低,体外制备CIK或DC-CIK细胞 （1x1010以上）,回输CIK或DC-CIK细胞给患者（两周一次，至少4次）,杀伤残留的肿瘤细胞，抑制肿瘤的复发和转移,（五）自然杀伤细胞,自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）来源于造血细胞，其发育成熟依赖骨髓及胸腺微环境，是机体重要的免疫细胞，与抗肿瘤、 抗病毒感染和免疫调节有关。 NK细胞其无须预先接触抗原即可杀伤靶细胞(如病毒感染的宿主细胞和肿瘤细胞)，由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制，因此称为自然杀伤活性，其在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用。,自体自然杀伤细胞（NK cells）,PBMNC （30-40ml 外周血）,68个175cm的培养瓶,诱导NK培养试剂 IL-2,NK细胞数量可达 23109,培养12-14天,NK细胞的表型是以CD56阳性为主的细胞群,自体NK细胞的治疗策略,体外诱导NK细胞,回输NK细胞给患者（两周一次，至少4次）,回输的NK细胞能提高机体免疫功能,杀伤残留的肿瘤细胞，抑制肿瘤的复发和转移,常规治疗尽可能使肿瘤负荷降低,根据不同肿瘤的生物学特性（肿瘤类型、分期和肿瘤的免疫源性）、患者的遗传背景（是否具有家族倾向？）、目前的病情状况（体质，免疫状况）、前期治疗方法、年龄等，在常规治疗的基础上，制定出适合病人的个体化体细胞免疫治疗方案。,二、制定适合病人的个体化体细胞免疫治疗方案,（一）针对老年肿瘤晚期患者，体质弱、免疫功能极度低下采取抽少量血多次回输的治疗方案,抽血30-40ml外周血,第1天,第3次CIK回输,第2次CIK回输,第4天,第8天,第12天,第14天,第16天,开始下一个疗程的治疗,第1次CIK回输,(二）化疗联合细胞治疗的增效方案,化疗前1天抽血50ml，进行CIK或D-CIK免疫细胞培养,第一周,第二周,7天,开始化疗,第2次开始化疗,回输CIK或D-CIK等细胞,化疗前1天抽血50ml，进行CIK或D-CIK免疫细胞培养,（三）体细胞免疫治疗联合放疗的增效方案,放疗前抽外周血50ml， 上午放疗前,放疗,放疗,放疗,两周后，当天放疗后回输免疫细胞,第2天 周二,第3天 周三,第1天 周一,第4天 周四,第6天 周六,第7天 周日,第5天 周五 回输培养的CIK、 NK、D-CIK等细胞,休息,休息,（四）抗肿瘤效应细胞交替使用方案,第二周D-CIK,第三周NK,第四周D-CIK,抽血30ml,回输NK,抽血50ml,抽血30ml，回输NK细胞,抽血50ml，回输D-CIK细胞,第五周NK,第六周D-CIK,回输D-CIK,第一周NK,（五）体细胞免疫治疗联合抗肿瘤的细胞因子，抗肿瘤抗体，生物分子靶向药物增强疗效的方案,Threshold for tumor regression,Immune stimulation/ inflammation,Spontaneous release of immune modulators by tumor cells,Spontaneous regression/ response to therapy,Tumor progression,Antigen-specific Immunization，生物靶向药物 （抗肿瘤抗体和小分子化合物）,NK cells，CIK cells，D-CIK, IL-2.IFN-,（六）体细胞免疫治疗联合肿瘤常规治疗的基本原则,恶性肿瘤,手术治疗,放化疗敏感 (常规放化疗) 放化疗间隙联合细胞免疫治疗 （卵巢癌，乳腺癌，小细胞肺癌和鼻咽癌等）,疾病稳定期,专科治疗 （微创介入）,不能手术（期，期）复发者,可手术,放化疗不敏感 （肾癌，前列腺癌，黑色素瘤和肝癌等）,细胞免疫治疗,细胞免疫治疗 联合专科治疗,（靶向治疗）,细胞免疫治疗联合内分泌或靶向治疗，细胞因子治疗,细胞免疫治疗,化疗不敏感 （原发性肝癌，肾癌， 黑色素瘤和前列腺癌等）,疾病稳定期,放化疗敏感 (常规放化疗) 放化疗间隙联合细胞免疫治疗 （卵巢癌，乳腺癌，小细胞肺癌和鼻咽癌等）,三、体细胞免疫治疗联合肿瘤常规疗法增效举例,（一）微创介入联合CIK治疗原发性肝癌的增效作用 Journal of Immunotherapy: 2008, 31 (1): 63-71.,肝癌的手术和局部病灶的栓塞化疗（TACE and Operation） 器官水平的整体治疗（Entirety therapy in organ-level ） 射频消融（RFA ） 局部的强化治疗（Focal intensive therapy） 体细胞免疫治疗（Adoptive cell Immuninotherapy 杀伤微小的肿瘤病灶（Aim directly at microscopic lesions or sub-image lesions）,原发性肝癌个体化治疗模式研究,6 weeks,218 Cases,TACE (12Times) + RFA (12Times ),No recurrence,85 recipients （randomised ）,Group A 45 recipients,Group B 45 recipients,Followed by （ CT, PET-CT ）,Following up,CIKs transfusion,recurrence,Out of Study,18M,18M,技术路线 （Road Map）,The expression of surface markers of CIK cells from 1 patient. The percentages of CD3+CD56+, were 34.5%,Cytotoxicity effects of CIK cell in vitro. The percentages of cytotoxicity against HepG2, HuH-7, SK-hep1, and K562 were 29.2 2.7%, 69.7 0.8%, 88.9 2.6%, and 47.6 4.0%, respectively, for the 100:1 effector:target cell ratio. With the decreased ratio of effector and target cells, the cytotoxic effects of CIK cells correspondingly became weaker.,Intracellular cytokine production of CIK cells from some patients. The IFN- positive percentage of CIK cells was 71.8 5.2%; however, almost none of IL-4 (0.1 0.02%) was produced. In controls, the positive percentages of IFN - and IL-4 were 2.6 0.3% and 1.9 0.3%, respectively.,CIK细胞能分泌大量的IFN-，并且降低IL-4的分泌使免疫细胞分泌更多的Th1型细胞因子，从而刺激更强的Th1型免疫，从而发挥更强抗肿瘤能力,Figure 5 85名原发肝癌患者生存曲线 CIK治疗组6、12、18个月时无复发生存率分别为93.3%、 91.1% 、74.4%；对照组则分别为90.0%、70.0%、60.0%。,(二)自体CIK细胞联合GC方案化疗治疗转移性鼻咽癌的临床研究 Journal of Immunotherapy: 2012, 35 (2): 189195,研究背景,鼻咽癌是中国南方最为常见的恶性肿瘤； 鼻咽癌恶性度高，易发生远处转移。鼻咽癌放疗后发生远处转移则预后差； 对于发生远处转移的鼻咽癌病例，目前尚无标准的化疗方案； 因此，需要探讨化疗药物联合其它治疗的综合治疗方案。,临床试验的研究目的,GC方案化疗（吉西他滨+顺铂）联合CIK细胞治疗转移性鼻咽癌的有效性； 观察GC方案化疗联合CIK细胞治疗转移性鼻咽癌患者的近期疗效（CR、PR）及远期疗效（总生存期OS、无疾病进展生存期PFS）,技术路线,60例转移性鼻咽癌患者 随机分为2组,30例行GC+CIK生物化疗,30例行GC化疗,抽外周血行CIK细胞培养,CIK细胞回输 安全性观察,抽血后当天 行GC化疗,培养2周后回输 CIK细胞,2组近期疗效比较,2组远期疗效比较,2组化疗急性毒副 反应比较,GC+CIK方案化疗联合CIK细胞治疗实施过程,抽取患者外周静脉血送 实验室行CIK细胞培养,CIK细胞回输,抽血后当天行 GC方案化疗,抽取患者外周静脉血送 实验室行CIK细胞培养,抽血后当天行 GC方案化疗,.,.,病例随访,随访时间从完成4个疗程的GC方案化疗联合CIK细胞治疗起，随访时间不少于两年。 总生存时间（Overall survival，OS） 无进展时间（Progression free survival, PFS）,60例鼻咽癌放疗后伴远处转移病例临床特征,近期疗效（第4个疗程完成后一个月）,如上表可见，GC+CIK生物化疗近期疗效优于GC化疗组 （21 Vs 14)，尽管2组间无统计学差异，p值接近0.05,远期疗效-OS,从OS生存曲线可见，尽管无统计学差异，GC+CIK组总生存期高于GC组，其差异随随访时间延长而有增大趋势,远期疗效- PFS,从PFS生存曲线可见，GC+CIK组无进展生存期显著高于GC组，表明GC+CIK组可有效改善转移性鼻咽癌患者的预后,结论,GC方案化疗联合CIK 细胞治疗转移性鼻咽癌安全性好、毒副反应小、患者依从性好； 与单纯的GC方案化疗相比，GC+CIK生物化疗可提高患者的近期疗效，延长患者的总生存时间，并显著延长患者无进展生存时间； CIK细胞联合GC方案化疗治疗转移性鼻咽癌可能具有增效作用。,肺癌 （病例一）,患者男 70岁 住院号：151182 综合科 入院诊断：左上肺腺癌 第一次住院行诱导化疗，后先后行gamma刀治疗及射频消融治疗，并于2005.12.6-2007.6.21 共行CIK治疗：26次；DC-CIK治疗：15次。出院时一般情况好，肿瘤标志物无升高，脑无占位，肺部病灶及纵隔淋巴结均无活性,到现在无瘤生存已36个月，这个病人是综合治疗的范例。,（三）肿瘤多学科综合治疗举例,乳腺癌（病例一）,病人，女，69岁，左乳腺癌术后患者。患者因左乳腺肿物3年于2004-7-29行左乳癌改良根治术，用环磷酰胺+阿霉素+5-氟脲嘧啶方案化疗2程，2004-10-22至2004-12-17行NK细胞回输6次,2005年4-9月行CIK细胞回输6次每年接受8次体细胞免疫治疗。2007-11-20 PET-CT示未见复发。 2011-10-18 PET-CT检查未见复发。目前，患者每年接受68次细胞免疫治疗。,病人 女 50岁 2009.3.17 PET-CT提示左乳肿物 2009.3.20 左乳区段切除+左腋窝淋巴结清扫术 术后病理：大小为2x1.5x1.5cm，浸润性导管癌，级，ER(-)，PR(-)，Her-2(-) 术后分期：T1N1M0，A期 2009.4.10-09.8.7 行剂量密集型“ACT”化疗各4程 2009.8.31-09.10.14 左乳+左锁骨上放疗 2009.6-10.8 细胞免疫治疗共24次，其中NK 8次，D-CIK 12次，CIK 4次，疗程间无长时间间隔。 2011.8至今 每月接受一次细胞治疗，病情稳定，一般情况良好。,乳腺癌（病例二）,病人 男 50岁 盲肠癌 （Dukes D, 肝转移）,200.12 CEA升高，肠镜病理：腺癌级，PET-CT：盲肠癌并肝转移瘤采用手术和化疗、生物治疗的综合治疗方案：术前新辅助化疗3次，术后辅助化疗9次，手术化疗期间均配合C225及细胞免疫治疗，之后进行以细胞免疫治疗为主的治疗。 具体过程：08.1.7-08.2.4 XELOX化疗3次 2008.2.22 右半肝切除术+肝内一个转移瘤切除术+区域淋巴结清扫术 2008.3.11 肝内另一个转移瘤射频消融治疗 2008.3.18 -08.7.8 CR+5Fu化疗1次，FOLFIRI化疗8次 2008.1-09.1 细胞免疫治疗22次，其中NK 6次，D-CIK 5次，CIK 10次， D-T 1次 2009.1- 至今 每月接受一次细胞治疗，病情暂稳定。,（四）体细胞免疫治疗联合抗肿瘤的细胞因子，抗肿瘤抗体，生物分子靶向药物