维生素类药物分析

第十二章 维生素类药 物的分析,基本要求,一、掌握维生素A、B1、C、E的结构性质与分析方 法之间的关系； 二、掌握维生素B1、C、E的含量测定原理和方法。 三、了解维生素A的含量测定原理和方法。 四、了解维生素D性质和分析特点。,维生素： 是维持人体正常代谢机能所必需的 微量营养物资。 人体不能合成维生素。,概 述,VitA、D2、D3、 E、K1 等,脂溶性,水溶性,VitB族(B1、B2、B6、B12) VitC、叶酸、烟酸、烟酰胺,VitM,VitPP,第一节 维生素A的分析,维生素A1 活性最高，维生素A2的生物活性是维生素A1的30-40%，维生素A3的生物活性是维生素A1的0.4%，故通常所说的维生素A系指维生素A1。,来源： 1.天然产物 主要来源于鲛类无毒海鱼肝脏中提取的脂肪油,即鱼肝油。从鱼肝油提取的VA多为各种酯类的混合物，其中主要为醋酸酯和棕榈酸酯。,来源： 2.人工合成产物 全反式维生素A醋酸酯 中国药典收载的VA是人工合成的VA醋酸酯结晶加精制植物油制成的油溶液，其制剂有VAD胶丸和VAD滴丸。,药典收载情况：,-H 维生素A醇 -COCH3 维生素A醋酸酯 -COC15H31 维生素A棕榈酸酯,R :,维生素A,环己烯,共轭多 烯侧链,存在多种立体异构化合物 具有UV吸收 易发生脱氢、脱水、聚合 反应,为一个具有共轭多烯侧链的 环己烯,（一）,具有UV吸收,存在多种立体异构化合物,维生素A 325.5 (全反式)100% 新维生素Aa 328 (2-顺) 75% 新维生素Ab 320.5 (4-顺) 24% 异维生素Aa 323 (6-顺) 21% 异维生素Ab 324 (2，6-顺) 24%,相对生物效价,VitA2,VitA3,易发生脱氢、脱水、聚合反应,鲸醇,或有金属离子存在时氧化,环氧化物,VitA醛,VitA酸,CHCl3,不溶于水 易溶于有机溶剂和植物油等,条件 无水无醇,CHCl3,蓝色,紫红,（BP（1998）,max为326nm 一个吸收峰,max为350390nm 三个吸收峰,去水VitA（VitA3）,VitA,USP 显色剂 磷钼酸 规定斑点颜色和Rf值,BP 杂质对照品法 显色剂 三氯化锑,立体异构体 氧化产物及光照产物 合成中间体 去氢维生素A（ VitA2） 去水维生素A（ VitA3）,UV法,（一）,三点校正法 1. 条件： （1）杂质的吸收在310340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小； （2）物质对光的吸收具有加和性。,2. 波长的选择： （1） 1 VitA的max（328nm） （2） 2 3 分别在1的两侧各选一点,测定对象 VitA醋酸酯,第一法 等波长差法,第二法 等吸收度法(皂化法),测定对象 VitA醇,测定法 （1）基本步骤: 第一步 A选择 选择依据： 所选A值中杂质的干扰已基本消除,注意： C 为混合样品的浓度,第二步 求,第三步 求效价,换算因数由纯品计算而得：,第四步：求标示量,方法：,（2）,第一法,维生素A醋酸酯,判断 是否在326329nm之间,在326329nm之间,改用第二法,是,否,求算 并与规定值比较,规定值 差值,判断差值是否超过规定值的,有一个以上超过,无超过,计算 A328（校正）,用A328计算,第二法,第二法,VitAD胶丸中VitA的含量测定 精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0.08262g/丸）的内容物 0.2399g 至250ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一20 ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度为,A300 ：0.354 A316 ：0.561 A328 ：0.628 A340 ：0.523 A360 ：0.216,A300 /A328 ：0.555 A316/A328 ：0.907 A328/A328 ：1.000 A340/A328 ：0.811 A360/A328 ：0.299,求本品中维生素A的含量？,A300 /A328 ：0.564 A316/A328 ：0.893 A328/A328 ：1.000 A340/A328 ：0.833 A360/A328 ：0.344,0.555 0.907 1.000 0.811 0.299,+ 0.01 0.01 0 + 0.02 + 0.04, ,= = = = =,适用于维生素A醇,（等吸收度法）,第一法无法消除杂质干扰时用此法, 皂化法、6/7A法 ,（3）第二法,水溶性,脂溶性,判断max是否在323327nm之间,取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定,计算,是,否,判断 A300 /A325 是否大于0.73,是,否,取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定,计算A325(校正),0,3%,3%,三氯化锑比色法,（二）,优点 简便 快速,max 618nm620nm,标准曲线法,氨基嘧啶环CH2噻唑环(季铵碱),维生素B1,HCl,Cl-,还原性,（一）,溶解性,1、易溶于水,2、水溶液呈酸性,（二）,UV,共轭双键,max = 246nm,嘧啶环 伯氨,噻唑环 季铵,1、可与酸成盐,2、与生物碱,3、含量测定 非水碱量法,（三）,硫色素反应,（四）,碱性,ChP,硫色素,2H,VitB1,H+,H+,H+,H+,S元素反应,Cl-反应,喹那啶红亚甲蓝 （紫红天蓝）,UV法,（二）,片剂、注射剂,= 421,（每片）相当于标示量的%=,A = ECL,规格 g/片,g/100ml,g,ChP,（每ml）相当于标示量的%=,规格 g/ml,ml,准确度高 灵敏度低 操作繁琐 设备简单,2337.27,3479.22,取本品约50mg，精密称定，加水50ml溶解后，加盐酸2ml，煮沸，立即滴加硅钨酸试液4ml，继续煮沸2分钟，用80恒重的垂熔玻璃坩埚滤过，沉淀先用煮沸的盐酸溶液（120）20ml分次洗涤，再用水10ml洗涤1次，最后用丙酮洗涤2次，每次5ml，在80干燥至恒重，精密称定，所得重量与0.1939相乘，即得,例,精密称取本品0.0519g，加水50 ml溶解，加盐酸2ml煮沸，立即滴加 硅钨酸试液4 ml，继续煮沸2分钟，用 80恒重的垂熔玻璃坩埚滤过，沉淀 先用煮沸的盐酸溶液（120）20 ml 分次洗涤，再用水10ml 洗涤1次，后 用丙酮洗涤2次，每次5ml。在80干 燥至恒重，称得沉淀重量为0.2557g。 求本品的含量按干燥品计算为多少？,(本品干燥失重项下测定结果为3.73%),A. 取样量50mg 提高灵敏度,B. 80 保持4个H2O,C. HCl 增大沉淀颗粒,D. 硅钨酸 ：VitB1 = 8 ：1 使沉淀完全,E. 硅钨酸边搅拌边缓慢加入 增大沉淀颗粒,NaOH,激发波长365nm 发射波长435nm,+ NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 + NaOH + 异丁醇,+ NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 + NaOH + 异丁醇,S,d,A,b,对照液,供试液,（1）灵敏度高，线性范围宽 （2）代谢产物不干扰，适用于 体液分析,维生素C,L抗坏血酸,两个手性碳原子，有四个光学异构体,二烯醇强还原性,弱酸性（一元酸）,二烯醇结构,二酮基结构,二烯醇结构,有活性,有活性,无活性,糖类的显色反应,50,结构与糖类相似,C3OH的 pKa = 4.17,C2OH的 pKa = 11.57,一元酸,L(+)抗坏血酸 活性最强,手性C（C4、C5）,*,*,与碱反应,1、与AgNO3反应,2、与2，6 - 二氯靛酚反应,(ChP2000),氧化型,玫瑰红色,(ChP2000),（玫瑰色）,（无色）,3、与碱性酒石酸铜反应,USP,4、与KMnO4反应,或盐酸,50,吡咯,USP,（蓝色）,(糠醛),（戊糖）,BP,0.01mol/L HCl,指示剂 淀粉指示液,H+,取本品约0.2g，精密称定，加新 沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶 解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴 定液（0.1mol/L）滴定，至溶液显蓝 色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液 (0.1mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6,（1）酸性环境 d . HCl,（2）新沸冷H2O,减慢VitC被O2氧化速度,（3）立即滴定,赶走水中O2,减少O2的干扰,（4）附加剂干扰的排除,片剂 滑石粉 过滤,USP,JP,（2）快速滴定 2min内,（1）酸性环境 HPO3-HAc,稳定VitC,防止其他还原性物质干扰,（3）剩余比色测定,（定量过量）,（测剩余染料）,（4）缺点,需经常标定,贮存一周,干扰多 氧化力较强,1、HPLC的优点,灵敏度高,选择性高,分离分析同步,微量分析,干扰少,快速,2、HPLC法分离VitC常用方法及测 定对象,对象 制剂、生物样品、果汁,方法 离子交换色谱法 离子对色谱法 分配色谱法（正、反相）,血、尿、组织、细胞等,例,多种维生素片中VitA、 VitB1、 VitB2 、VitB6 、烟酰胺、VitC、 VitE的含量测定,色谱柱 ODS 流动相 A、水 -甲醇（4 ：1） B、甲醇 （梯度洗脱） 抗氧剂 二巯基丙烷磺酸钠,水溶性维生素 离子对色谱法（樟脑磺酸） 内标法 + 校正因子 内标物苯酚,脂溶性维生素 外标法,维生素D,维生素D2,一、结构与性质,维生素D3,开环的甾体：具有甾类化合物的显色反应，可用于鉴别。,手性碳原子：具有旋光性，可用于鉴别。,多烯：可进行紫外检测。,二、鉴别试验,1. 显色反应,三氯化锑反应 橙红色渐变粉红,三氯化铁反应 橙黄色,二氯丙醇和乙酰氯反应 绿色,2. 比旋度鉴别,维生素D2,维生素D3,溶 剂,浓 度,比旋度值,无水乙醇,无水乙醇,40mg/ml,5mg/ml,+102.5+107.5,+105+112,注意事项：应于容器开启30分钟内取样， 在溶液配制后30分钟内测定。,3.区别反应： 以96%乙醇为溶剂，加乙醇和85%硫酸，D2 显红色，在570nm处有最大吸收，D3显黄色， 在495nm处有最大吸收。,4.其他方法： TLC、HPLC、制备衍生物测熔点,三、杂质检查,维生素D2中麦角甾醇的检查：加洋地黄皂苷溶液，混合，放置18h不得发生浑浊或沉淀。,前维生素D的光照产物,四、含量测定方法,中国药典（2000年版）采用正相高效液相色谱法测定维生素D的含量，定量方法为内标法，内标物为邻苯二甲酸二甲酯，该法分为三个方法。 固定相：硅胶 流动相：正己烷-正戊醇（997：3）,第一法：用于无维生素A醇及其它杂质的干扰的情况，步骤如下： 1系统适用性试验：测定重复性和分离度。,2测定校正因子： A S /m S f1 = - A r /m r f2 =（A S m r- f1 m S A r1）/（A r1 m S）,3含量测定： mi=（f1 Ai1+ f 2 A i2）m S /A S,第二法：用于有杂质的干扰的情况，步骤如下： 1皂化处理：皂化、乙醚提取、洗涤提取液、蒸除乙 醚、制备供试液A。 2净化：供试液A经液相色谱分离，准确收集含有维 生素D及前维生素D混合物的全部流出液，制 备成供试液B。 固定相：ODS 流动相：甲醇-乙腈-水（50：50：2） 3含量测定：取供试液B按第一法测定。,第三法：用于经第二法处理后仍有杂质的干扰的情况。步骤如下： 1制备供试液：取供试液A，净化，水浴加热，得供 试液C。 制备对照液：对照品储备液：稀释、加热。 2含量测定：在第一法的色谱条件下，交替精密进样 对照液和供试液，按外标法定量。,苯并二氢吡喃醇,维生素E,苯环 + 二氢吡喃环 + 饱和烃链,*,*,*,生物效价 右旋体 ：消旋体 = 1.4 ：10,（天然品）,（合成品）,dl生育酚醋酸酯,结构与性质,一、,苯环 + 二氢吡喃环 + 饱和烃链,1、易溶于有机溶剂，不溶于水,2、UV,3、酯键 易水解,（一）,硝酸反应,橙红色,（橙红色）,生育红,生育酚,HNO3,强氧化剂,取本品约30mg，加无水乙醇10ml溶解后，加硝酸2ml，摇匀，在75加热15分钟，溶液应显橙红色。,三氯化铁联吡啶反应,（二）,生育酚,对-生育醌,弱氧化剂,红色,= 41.045.5,max = 284nm,min = 254nm,0.01%无水乙醇中,维生素EUV图,薄层板 硅胶G,展开剂 环己烷 -乙醚（4 ：1）,显色剂 硫酸（105 5）,VitE Rf = 0.7,游离生育酚,硫酸铈滴定液（0.01mol/L） 二苯胺（亮黄灰紫）,利用游离生育酚的还原性， 将硫酸铈还原成硫酸亚铈,试剂,（二）,（M生育酚= 430.8）,例,取本品0.10g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液1滴，用硫酸铈液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸铈液（0.01mol/L）不得过 1.0ml。,2.15,药典规定,消耗硫酸铈液（0.01mol/L）1.0ml,设：应消耗硫酸铈液 V ml,0.011.0 实际浓度 V,若硫酸铈液浓度不是0.01000mol/L， 应重新计算硫酸铈的消耗量,例 Ce(SO4)2 = 0.01020mol/L,GC法,（一）,GC特点,1、,选择性好 灵敏度高 速度快 分离效能好,挥发性低、不稳定、极性强衍生化易受样品蒸气压限制,载气N2 固定液硅酮（OV-17） 担体硅藻土或高分子多孔小球 柱温265 检测器氢火焰离子化检测器(FID) 内标正三十二烷 n 500 R2,内标法加校正因子,内标法,供试液（样品+内标）,内标物,对照液（对照+内标）,校正因子：,实际工作中的计算方法,例,内标液 取正三十二烷加正己烷溶解 并稀释成1.0mg/ml溶液,对照液 精密称取VitE对照品0.2011g 置棕色具塞锥形瓶中，精密加入内 标液10ml，密塞，振摇使溶解，取 13ul注入GC仪，测定，计算,供试液 精密称取供试品0.1998g置棕 色具塞锥形瓶中，精密加入内标液 10ml，密塞，振摇使溶解，取13ul 注入GC仪，测定，计算,对照液,供试液,本品含C31H52O3应为96.0 102.0%,BP GC 内标 正三十二烷 R1.4,USP GC 内标 十六酸十六醇酯 R1.0,JP HPLC 外标 dl生育酚 R1.4,利用生育酚的易氧化性,还原型,氧化型,二苯胺（亮黄灰紫）,防止Ce(SO4)2的水解 减慢生育酚被O2氧化速度,C、酸性条件,Ce(SO4)2易溶于水 生育酚易溶于醇,B、溶剂,分子量较大，反应慢 易被O2氧化,A、反应速度,MVitE = 472,样品 dl生育酚 固定相十八烷基硅烷键合硅胶 流动相甲醇-水（49 ：1） 检测波长292nm R2.6 RSD0.8%,测定对象血清中VitA和VitE 固定相十八烷基硅烷键合硅胶 流动相甲醇-水（96 ：4） 检测波长 8前330nm 8后292nm,练 习 题 1.下列药物的碱性溶液，加入铁氰化钾 后，再加正丁醇，显蓝色荧光的是 A. 维生素A B. 维生素B1 C. 维生素C D. 维生素D E. 维生素E,2既具有酸性又具有还原性的药物是 A. 维生素A B. 咖啡因 C. 苯巴比妥 D. 氯丙嗪 E. 维生素C,3.维生素C的鉴别反应，常采用的试剂有 A. 碱性酒石酸铜 B. 硝酸银 C. 碘化铋钾 D. 乙酰丙酮 三氯醋酸和吡咯,4. 测定维生素C注射液的含量时，在操作过程中要加入丙酮，这是为了 A. 保持维生素C的稳定 B. 增加维生素C的溶解度 C. 使反应完全 D. 加快反应速度 E. 消除注射液中抗氧剂的干扰,5：14 可发生以下反应或现象的药物为 A.维