口腔粘膜细胞基因组DNA制备医学PPT课件.ppt

分子医学技能实验,袁 洁 生物化学教研室,实验一 口腔粘膜细胞基因组DNA制备,1,基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。 是一般的基因工程实验中DNA操作的最初步骤。,一、基因组DNA的提取与纯化,目的：,2,二、人基因组DNA的制备,实验目的及意义： 从人口腔上皮细胞中提取纯的基因组DNA 掌握基因组DNA抽提的方法，理解核酸分离纯化的基本原理,3,分离纯化基因组DNA的常用方法：,不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，分离方法也有差异。主要根据不同细胞的特点而有区别，但原理相似，因此它们有共同的步骤： 裂解细胞：SDS裂解细胞，EDTA抑制核酸酶 除去蛋白质：蛋白酶K水解蛋白质，酚和氯仿/异戊醇抽提、分离蛋白质； 析出DNA：乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。,4,细胞样品的核酸提取的主要步骤,破碎细胞 去除细胞内的其它分子： 蛋白质 多糖 脂类 去除盐类、有机溶剂等杂质,5,实验材料及试剂,材料：人口腔上皮细胞 试剂： 抽提缓冲液：Tris-Cl pH8.0 ，EDTA，NaCl， RNAase， SDS，蛋白酶K 水饱和酚 氯仿/异戊醇（V/V=24:1） 70%乙醇、无水乙醇 TE缓冲液：Tris，EDTA,6,主要试剂的功能,抽提缓冲液：由SDS、EDTA、蛋白酶K组成 SDS的作用是裂解细胞 EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子，防止DNA酶对DNA分子的降解作用。 蛋白酶K的作用是水解蛋白质。 酚和氯仿/异戊醇：抽提分离蛋白质 乙醇：沉淀DNA TE：溶解DNA,7,取材:用生理盐水漱口后，口含生理盐水1015ml约23min，用15ml离心管（4000rpm 10min）收集细胞沉淀 （离心机的使用，平衡） 加入0.5ml抽提缓冲液，重悬沉淀 ，转移至1.5ml EP管 （微量移液器的正确使用） 混匀，65 温育30min 加入等体积的【饱和酚(0.25ml)：氯仿/异戊醇(0.25ml)】 充分颠倒混匀,（不要剧烈震荡！）,实验步骤及注意事项（一人一份）：,8,12000rpm5min，上层水相转移至新的EP管 （高速离心机的使用与安全意识） 加入等体积【氯仿/异戊醇】，颠倒混匀 12000rpm5min，上层水相转移到新的EP管,加入2倍体积 无水乙醇，颠倒混匀 12000rpm10min,9,弃上清，沉淀中加入300 l 70%乙醇 12000rpm2min 轻轻弃去上清，打开EP盖，室温静置510min 加入30-50 l 0.1TE溶液，充分混匀后检测结果,10,核酸分离纯化的原则： 保证核酸一级结构完整 排除其它分子的污染： 细胞内：蛋白质、脂类、糖、RNA等 提取过程中：有机熔剂、金属离子、外源DNA,11,核酸提取注意事项,减少化学因素对核酸的降解 如过量酸碱 减少物理因素对核酸的降解 机械剪切力：强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融 高温 防止核酸的生物降解 核酸酶的预防,12,常见问题： 1、提取的DNA不纯 原因？改进的方法？ 2、提取的DNA成涂布状 原因？改进的方法？ 3、没有获得足够量的DNA 改进的方法？,13,分子医学实验注意事项,微量移液器的正确使用 离心机的正确使用 上课纪律 撰写实验报告的规范,14,实验结果及其分析,定性分析：DNA琼脂糖凝胶电泳 HLA基因多态性分析 PCR,下次实验课进行,15,预 习,电泳的原理 基因诊断、分子诊断 PCR的原理 乙肝病毒临床检测方法 HLA基因,16,实验报告格式,实验目的和应用价值 实验原理 样品与试剂 实验基本流程和注意事项 实验