分子生物学工具酶.ppt

10/24/2019,分子生物学工具酶,中晶生物,10/24/2019,工具酶是一类用于DNA重组过程中不同DNA分子的制备、切割、修饰、扩增, 核酸分子的标记以及它们的核苷酸序列测定的酶。,概 述,分类： 限制性内切酶 连接酶 逆转录酶 DNA、RNA聚合酶 其它酶类,大多数来自不同的微生物和噬菌体 少数酶来自动物和动物病毒 另一些工具酶编码的基因也被克隆出来, 并用大肠杆菌细胞来生产这些工具酶。,10/24/2019,一、限制性内切酶,5-GA A T T C-3 3-C T T A AG-5,EcoRI,市场容量：1.5亿美金,10/24/2019,其命名以该酶来源的原核生物的名称为依据。 第一个大写字母：取自于属名的第一个字母 第二、三个小写字母：取自于种名的前两个字母 字母后面罗马字：该种生物中不同限制酶分离先后顺序 限制酶名称的前三个字母常用斜体或加下横线表示,限制酶的命名,分离纯化：几千种限制性内切酶 商品化：200多种限制性内切酶,限制酶的种类,10/24/2019,限制性内切酶,10/24/2019,限制性内切酶说明书,10/24/2019,Fermentas公司,30多年研发生产历史，提供200多种高质量的工具酶 通过ISO9002国际质量体系认证 精湛的实验室研发技术和实力 具有全球第二大的产限制酶的菌株 (2500株)库 REBASE 中30% 限制酶经过Fermentas的鉴定 30%II型限制修饰相关基因在Fermentas得到克隆 全球率先合成了“人造”酶(Eco57MI, N.Bpu10I) 生产中执行最高级别的生产标准（LO Test） 致力于通过提高生产效率从而提升产品质量和价格竞争力 全球限制性内切酶(REs)生产的领先企业 市场份额：20左右，个别国家超过30的市场占有率,10/24/2019,执行最严格生产标准 PureExtreme,自 1996 年以来，只有Fermentas始终执行分子生物学产品生产中最严格的纯度标准 “标记寡核苷酸测试”（ the Labeled Oligonucleotide test，”LO” test） 独有的“标记寡核苷酸测试” 确保 Fermentas 产品达到 PureExtreme级别 在限制酶、 dNTPs、 DNA/RNA 修饰酶等的生产中都进行了 “标记寡核苷酸测试”,传统分析方法包括：非特异性核酸酶内切分析、核酸外切酶分析、连接重切分析、蓝白斑筛选分析等。 但是要检测痕量污染的内切、外切核酸酶，磷酸酶，必需选择更高灵敏度的检测方法：LO Test,10/24/2019,Labeled Oligonucleotide (LO) test,A Invitrogen B Roche C NEB D Stratagene E Promega F Fermentas,10/24/2019,不同供应商RE LO检测分析,-,pure,contaminated,minor contamination,X,*,10/24/2019,通过LO检测的REs(%),Roche,Invitrogen,NEB,Stratagene,Promega,Fermentas,10/24/2019,PureExtreme 限制性内切酶优势,所有Fermentas内切酶都达到 PureExtreme（致纯） 最高品质保证 产品投诉少 严格的批间一致性 保证产品质量稳定性 几乎所以的酶都采用标准浓度 10 units/l 实时质量监督,10/24/2019,所有Fermentas RE在优化Buffer中有100%活性,Easy-to-use Five Buffer Plus System,每个Fermentas RE含两种buffer： - 颜色区分，优化buffer： blue (B+) green (G+) orange (O+) red (R+) yellow (Y+/Tango) 和 - Universal Y+/Tango Double Digest buffer,浓度优化的BSA预先加入所有RE缓冲液中,10/24/2019,改进的 REsearch engine,10/24/2019,DoubleDigestion，双酶切,10/24/2019,DoubleDigest 提供DD最佳反应条件,10/24/2019,Fermentas RE畅销排行榜（Top 20）,BamHI BcuI (SpeI) BglII EcoRI Eco47III Eco57I HindIII MboI MnlI NotI,NcoI NdeI NheI PaeI (SphI) SacI SalI TaiI (MaeII) Tru1I (MseI) XbaI XhoI,补充：PstI,10/24/2019,与竞争对手的比较,Fermentas vs NEB,10/24/2019,与竞争对手的比较,Fermentas vs Takara,10/24/2019,与竞争对手的比较,LO 测试 达到PureExtreme: 无其它活性的污染 内切酶种类第二多 ISO9002 认证和质量控制 列出有效期, 通过实时监控保证100活性 Five Buffer Plus System，加有 BSA Y+/Tango，通用双酶切buffer 专注于内切酶方面 价格优势,未经 LO测试 内切酶种类少 有认证 11种 buffers及 Multi-Core 4, 不提供BSA 未提供双酶切的详细信息 非主要产品线 大幅度折扣,Fermentas vs Promega,10/24/2019,与竞争对手的比较,LO 测试 达到PureExtreme: 无其它活性的污染 内切酶种类第二多 ISO9002 认证和质量控制 Five Buffer Plus System，加有 BSA Y+/Tango，通用双酶切buffer 价格优势,未经 LO测试 有认证 非主要产品线 9种 buffers, 不提供BSA 未提供双酶切的详细信息 大幅度折扣,Fermentas vs Invitrogen,10/24/2019,FastDigest Restriction Enzymes,NEW!,10/24/2019,FastDigest 限制性内切酶,FastDigest,5min digestion,1l of enzyme,37oC temperature,ONE buffer,For ALL FastDigest enzymes,超过70多种FastDigest酶 数量快速增长,10/24/2019,产品特点 独特的产品线 酶切质粒DNA只需5 min at 37C 特殊的形式：1l enzyme 无需换算酶切单位 通用Buffer，针对所有的酶切实验 一种温度：37C反应 200ng 纯化的质粒DNA (5 min酶切) 适合单酶切、双酶切和三酶切反应 操作简单：无需考虑酶量、Buffer、温度和星活性,客户定位,10/24/2019,基因的体外突变等诸方面,限制性内切酶的应用,各种DNA分子的体外重组,限制酶谱的绘制,基因的亚克隆分析,基因和染色体结构的分析,10/24/2019,限制性内切酶使用常见问题分析（一）,Q1、DNA完全没有被内切酶切割 内切酶失活：标准底物检测酶活性 DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子：将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA 条件不适（试剂、温度）：检查反应系统是否最佳 DNA酶切位点上的碱基被甲基化：换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株 DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I）：换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌株中扩增 DNA位点上存在其它修饰：将DNA底物与DAN混匀进行切割验证 DNA不存在该酶识别顺序 ：换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证,10/24/2019,限制性内切酶使用常见问题分析（二）,Q2、DNA切割不完全 内切酶活性下降：用5-10倍量过量消化 内切酶稀释不正确 ：用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶 DNA不纯，反应条件不佳 ：同上 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰 ：同上 部分DNA溶液粘在管壁上 ：反应前离心数秒 内切酶溶液粘度大，取样不准 ：将内切酶稀释，增大取样体积 酶切后DNA粘末端退火 ：电泳前将样品置65保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性 ：使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡 过度稀释使酶活性降低 ：适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏 反应条件不适 ：使用最佳反应体系 识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序 ：加大酶量5-10倍,10/24/2019,限制性内切酶使用常见问题分析（三）,Q3、内切酶保存期内快速失活 保存温度不当 ：贮藏在含50%甘油的贮藏液中，-20低温保存 以稀释形式保存：稀释酶液不宜长期存放，应一次使用 贮藏缓冲液不适当：使用厂家推荐的贮藏缓冲液 低蛋白浓度：内切酶与500ug/ml的BSA一起保存,Q4、酶切后的DNA片段连接效率低 含磷酸盐的浓度高：透析，乙醇沉淀去除磷酸盐 内切酶失活不全或含有ATP酶：内切酶失活不全或含有ATP酶 平末端连接：加大T4 DNA Ligase用量 外切酶污染：减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA 连接缓冲液不合适 ：重新配制连接缓冲液,10/24/2019,限制性内切酶使用常见问题分析（四）,Q6、电泳后DNA片段的带型弥散，不均一 DNA上结合有蛋白质：电泳前上样液65加热5min，并加入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提纯化 内切酶中含有DNA外切酶：减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶,Q5、DNA片段数目多于理伦值 内切酶星状活性：检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量 其它内切酶污染：用DNA作底物检查酶切结果 底物中含其它DNA杂质：电泳检查DNA，纯化DNA片段,Q7、酶切后没有观察到DNA片段的存在 DNA定量错误（如RNA含量较高） ：用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量 在酶切反应液中形成非特异的沉淀 ：在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次,10/24/2019,DNA/RNA 修饰酶,10/24/2019,T4 DNA Ligase (LO tested) Klenow fragment T4 Polynucleotide Kinase T4 DNA Polymerase RevertAid M-MuLV Reverse transcriptases (LO tested) Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (LO tested) Ribonuclease Inhibitor Ribonucleases Calf Intestine Alkaline Phosphatase Shrimp Alkaline Phosphatase Proteinase K,Fermentas畅销修饰酶,10/24/2019,T4 DNA Ligase LO tested,单位： Fermentas 国际Weiss unit (ATP-PP exchange) NEB 粘端连接单位 1 Weiss单位 200粘端连接单位 相关产品： Rapid DNA Ligation Kit Rapid DNA Ligation & Transformation Kit,10/24/2019,Reverse transcriptases,AMV： 从禽类成骨髓细胞瘤病毒中分离，有RNase H活性，42时比M-MuLV稳定，最高逆转录温度高达72度（Finnzymes）。增加逆转录的特异性，适合具有二级结构的模板RT RevertAid M-MuLV (LO Test)： 从莫洛尼鼠白血病毒中分离，有RNase H活性。42度逆转录，最长可获得13kb的cDNA。 M-MuLV (RNase H- ) (LO Test)： 从莫洛尼鼠白血病毒中分离，消除了RNase H活性，适合合成全长的cDNA。 42度逆转录，最长可获得13kb的cDNA，产量比含有RNase H活性的酶要高很多。,10/24/2019,Ribonuclease Inhibitors（RNA酶抑制剂）,概述 非共价1:1结合RNase，抑制RNases - A, B, C活性。 对Bacterial RNases H, T1, 1, S1, U1, U2, CL3无效 LO Test：超纯，无其它酶蛋白污染 作用温度范围：25-55度，最佳反应稳定37度 适用PH值范围5.0-9.0,应用： RNA分离与纯化 体外转录，保证RNA转录本的完整性 cDNA合成： 保护模板RNA、增加cDNA产率、增加全长cDNA比例 RT-PCR：保护模板RNA，增加RT-PCR产率,10/24/2019,碱性磷酸酶（AP),应用: 除去载体和插入片段