基因克隆载体.ppt

第五章 基因克隆载体,1,基因克隆载体定义 通过不同途径将承载的外源DNA片段（基因）带入受体细胞且能在其中维持的DNA分子。也称DNA克隆载体。,2,1. 载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,3,2.必备条件 1、克隆位点(一个或多个) 2、能携带外源DNA片段进入受体细胞: 能自我复制，或整入染色体随受体细胞DNA复制而复制。 3、有用于选择克隆子的标记基因 4、安全性(不含损害受体的基因,不任意转入别的,尤其人的细胞) 意义：基因工程随载体系统的建立而兴起，构建新载体一直是基础研究的优先领域。,4,按克隆载体的来源分： 质粒 病毒或噬菌体 质粒与病毒或噬菌体DNA组成的 质粒与染色体DNA片段组成的,分 类,5,第一节 质粒克隆载体 定义： 以质粒DNA为基础构建而成的载体，适于原核和植物的基因转移、建立基因组文库和cDNA基因文库。,6,一、质粒适于载体构建的性质,、组成与构型 是染色体外裸露的双链DNA分子（细菌、真菌、蓝藻、绿藻）,7,构型：,l-DNA,oc-DNA,ccc-DNA,ccc,8,、分子大小： 100102 kb,9,、复制 特点: 在宿主细胞内； 单向； 质粒和宿主细胞双重遗传系统控制,拷贝数（宿主细胞内质粒与染色体数量之比值）,10,（）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定 严紧控制型：1-数个拷贝；大质粒 松驰控制型：10个以上拷贝；小质粒。 经氯霉素处理，宿主中质粒大量扩增（如ColE1拷贝数达3000个）。,11,（）质粒复制的控制因素 cop基因：指令宿主合成阻遏物，当质粒复制到一定拷贝数时，阻遏物也合成积累，直到阻止质粒的继续复制。,12,Pcop,cop,P/Orep,rep,ori,Cop,Rep,、质粒的不亲和性 (阅读教程p88,新版p105:两种解释) 亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒 不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中 意义：受体细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，最好不含内源性质粒,14,、质粒迁移（质粒的可转移性）,（1）含tra基因合成细胞表面物质（鞭毛） 质粒DNA入受体细胞,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），含tra基因的质粒，如F、Ti质粒等 非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用，不含tra基因的质粒，如Col、R的其它成员,15,（）迁移作用 某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定。 不含tra基因而含bom（ori）位点的质粒，当宿主细胞存在辅助质粒mob基因产物时，即可打开ori位点，非结合质粒借助接合质粒tra基因的产物而迁移入受体细胞。这种现象称,16,、显性质粒和隐蔽质粒,显性（表达型）质粒宿主因含某种质粒而呈现出新的性状，这种质粒称为显性质粒； 隐蔽质粒即使宿主内含有某种质粒，但无异样性状表露，这种质粒称为隐蔽质粒,17,显性质粒 质粒：含有氨苄青霉素Ap、氯霉素Cm、卡那霉素Km、四环素Tc、链霉素Sm等药物的抗性基因，可作为选择标记。 Col质粒 质粒 降解质粒 i质粒 隐蔽质粒 蓝藻内源质粒,18,二、 质粒克隆载体构建的基本策略 、能进行有效复制复制起始位点（最好是多拷贝） 、克隆位点组装MCS连杆 、选择标记基因抗性基因，Lac Z基因 、分子尽可能小（转化率高） 15kb，转化率 、组装各种“元件”，如启动子、终止子等,19,三、质粒克隆载体构建 过程：严密的实验设计构建（切割、修饰和连接重组） 构建原则 1、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如ori、选择标记、克隆位点、启动子和终止子 2、正确获得构建质粒克隆载体的元件 3、组装合适的选择标记基因 4、选用合适的启动子 5、构建过程力求简单,20,代表性实例 （一）pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建 、pBR322构建 质粒载体命名法则 “pBR322” p：质粒（plasmid ) BR：两位主要构建者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首 322：实验编号,21,22,pBR322构建过程(出发质粒：pMB1),23,pBR322的三个亲本：pMB1、pSF2124、pSC101 识别位点： Apr基因区（3个 ）： Pst、Sca 、Pvu Tcr基因区（7个 ）：BamH 、Scal 、EcoR、 Sph 、Nhe 、Nru 、Xma Tcr启动子区（2个 ）：Cla 、Hind pBR322分子大小：4363bp,24,25,26,优点: （1）较小的分子量 10kb以内DNA分子纯化过程中可避免断裂，pBR322易于自身纯化，且可克隆6kb左右的外源DNA （2）带有一个复制起始位点 保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。 （3）较高的拷贝数 经氯霉素扩培后达10003000 copys/cell，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便 （4）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择标记。插入失活（图解）,27,28,、pUC18/19质粒载体 命名pUCUniversity of California的科学家首先构建。 与pBR322区别： 乳糖操纵子的一个DNA片段（lac Z基因）替换Tcr基因； 组装了一个多克隆位点（MCS）连杆,29,pUC包括四个组成部分： （1）pBR322的复制起点(ori) （2）Apr基因，但DNA序列发生变化，不再含原来限制性核酸内切识别位点 （3）lacZ基因 （4）在lacZ基因内部靠近5端有一段MCS连杆,30,31,pBR322衍生的质粒 缺失bom位点 pBR325、 pBR327， pAT153，不具被动迁移作用，更安全,32,Lac Z筛选机制： 含乳糖操纵子的启动子、调节因子和 -半乳糖苷酶的N端146残基(-肽) 合成有活性的 基因（lac Z）的质粒载体+可编 -半乳糖苷酶 码C端部分残基的宿主(与Lac Z互补 的大肠杆菌) 在含IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）和 X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖） 蓝色菌落 的诱导培养基上培养 在N端-肽的编码区插入MCS 不影响lac Z基因功能 插入外源DNA 灭活lac Z基因 白色菌落,33,编码b-半乳糖苷酶,IPTG,X-gal,(酶的底物),lac promoter,蓝色菌落,IPTG可诱导lacZ形成肽链,该产物能与有缺陷的宿主细胞所编码的C-末端发生基因内互补，形成有活性的-半乳糖苷酶，分解底物X-gal使菌落呈现蓝色。 当外源基因DNA片段插入多克隆位点后, 使其编码的肽链失去活性, 使其不能形成-互补, 因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。,34,重组子的显色互补筛选法,35,-互补的原理,所谓基因内互补作用，在LacZ体系中,是指二个彼此互补的突变基因（突变体1只含LacI和LacZ的N端145个氨基酸的肽；突变体2缺乏LacZ的N端肽），它们编码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之间通过肽互补作用可呈现有功能的-半乳糖苷酶活性, 进而可分解底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）而产生半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-氯-青定蓝, 使菌落呈现出蓝色反应。然而，当外源基因DNA片段插入载体中LacZ 肽区段的多克隆位点后, 就会阻断序列的读码结构, 使其编码的肽失去活性, 使重组子所在的细菌不能完成-互补, 因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。根据这种-半乳糖苷酶的显色反应，可以检测和筛选出携有外源基因重组子克隆。此法又称蓝白筛选法。如图,非重组质粒: 不含有插入的 DNA蓝色菌落 重组质粒: 含有插入的 DNA: 白色菌落,非重组质粒,重组质粒,37,38,pUC质粒载体的优点 （1）分子量更小、拷贝数更高 （2）免疫组化法一步实现筛选鉴定重组体，省时 （3）MCS区方便转移外源DNA在不同载体系列中 “穿梭”，使具有两种不同粘末端的外源DNA 能直接克隆入pUC载体,39,（二）蓝藻质粒克隆载体pPKE2的构建 大肠杆菌质粒不能转化蓝藻 蓝藻内的质粒属隐蔽质粒 即：大肠杆菌源质粒复制起始点 + 蓝藻源质粒复制起始点 pPbs（1511bp） pPbs Cla 重组 pPRS-1 多次亚克隆 pPKE2 pBR322 组装CaMV35s启动子、MCS、rbcS终止子、Kmr基因,构建穿梭质粒,40,41,（三）农杆菌Ti质粒克隆载体的构建 Ti质粒：根癌农杆菌中引发植物产生肿瘤（冠瘿瘤）的质粒，故称Tumor inducing plasmid（Ti质粒）。 双链环状DNA分子，200250kb。,42,1、4个功能区：T-DNA区、Vir区、Con区、Ori区 （1）T-DNA区 Ti质粒进入植物细胞的只有约25kb部分，即T-DNA（transfer DNA)。左右边界各有一个25bp正向重复序列（LTS和RTS）称为边界序列，为T-DNA的转移和整合所必需。只要保留T-DNA的边界序列，中间序列被外源DNA片段替换，仍可转移整合到植物基因组中。 这是Ti质粒用于遗传转化的理论依据。,43,（2）Vir区 位于T-DNA区上游，其表达产物可激活T-DNA的转移，显示致瘤性。 （3）Con区 含有农杆菌之间接合转移有关的基因（tra)，可受宿主产生的冠瘿碱活化，使Ti质粒在细菌间转移，也即接合转移基因编码区。 （4）Ori区 复制起始区，调控Ti质粒自我复制。 Ti质粒克隆载体真正用于植物而非农杆菌，农杆菌只起中介作用。,44,Ti质粒作为载体的问题 i) 太大，无适合克隆位点 ii)T-DNA的存在不能使转化细胞再生为完整植株 故不能达到直接选育转基因植物的目的,45,2、构建途径 （1）取代型载体 用大肠杆菌质粒克隆载体取代Ti质粒的全部或部分T-DNA序列而构建。外源基因以同源交换而重组。 Onc- Ti：T-DNA上的onc基因被取代而构建。 Onc+ Ti：pBR322取代 T-DNA的部分序列但保留onc基因而构建。进入植物细胞诱发冠瘿瘤。,46,（2）中间质粒克隆载体 将T-DNA的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建。 共整合克隆载体系统（T-DNA同源序列、bom 位点） 双元克隆载体系统微型Ti质粒,47,（四）乳酸杆菌质粒克隆载体 乳酸杆菌：G+，非致病，益生菌，用于食品和饮料。 乳酸杆菌质粒：小质粒，宿主范围广泛，可用于其它G+菌及大肠杆菌。 乳酸杆菌质粒克隆载体的构建： 用于其它G+菌及大肠杆菌; 乳酸杆菌本身对km、Ap抗性较强。 标记基因： 选用lacZ，如有pLJ1复制启始位点的pBG10 选用ery，如有p353-2复制启始位点的pP3537,48,（五）酵母2m质粒克隆载体 几乎所有酿酒酵母中都存在,（1）2m质粒结构 a、环状分子内有反向重复序列IR1和IR2，可发生重组，形成A、B型质粒；有ori复制起始点能自主复制。,图3-10 A型酵母2m质粒,b、2080个/细胞。有丝分裂时数目稳定，减数分裂时形成cir+/cir0,49,（2）YEp克隆载体（酵母游离型质粒） 2m质粒的ori EcoR酶切 pBR322质粒 酵母染色体URA3基因Hind酶切 YEp24,50,特征 （1）保留了pBR322的和筛选大肠杆菌克隆子 （2）含URA3标记筛选酵母菌克隆子 （3）URA3基因补偿酵母菌ura3突变 优点 （1）是一种穿梭质粒，可在酵母菌和大肠杆菌中复制 （2）转化率高，1gDNA可获得约104105个克隆子 （3）稳定高拷贝复制 故可用酵母菌高水平表达外源目的基因,51,（六）TA克隆载体针对PCR产物的克隆,故可研制一种线性载体，其5端各带一不配对T，可直接与PCR产物以TA连接进行克隆，即TA克隆。,原理 PCR产物在Taq酶的非模板依赖活性作用下，于3端加一非配对的A。,52,53,TA克隆,54,2019/10/26,55,TA载体的再生方法 （1）克隆载体线性化 （2）克隆载体末端补平反应 （3）克隆载体末端加T反应 注：再生后的TA载体，原线性化的酶切位点消失,56,5-GGCTGGCTGG NNNCAGGTATATTGNNNNGTAAAC AAATTGACGC-3,LB,5-TATCAGTGGT GACAGGATATATTGGCGCGTAAAC AAATTGACGC-3,RB,图 T-DNA的LTS核苷酸序列（LB）和RTS核苷酸序列（RB）,57,MCS连杆,58,第二节 病毒（噬菌体）克隆载体,病毒基本结构： DNA（或RNA）+ 外壳蛋白 感染细菌的病毒，称为噬菌体 分类（根据病毒与宿主的关系） 温和性病毒： 溶原性增殖构建病毒载体 烈性病毒： 溶菌性增殖改造后,59,一、噬菌体克隆载体,（一） 噬菌体性质 DNA + 外壳蛋白 1、DNA (48.5kb) 噬菌体中：线性 宿主细胞：环状(cos位点),60,2、噬菌体基因组有基因50个以上,J与N、P与Q之间为非必需序列,61,3、 限制性核酸内切酶位点: 56种（p477） 4、 噬菌体的生长途径 溶菌生长途径 溶原生长途径宿主合成int基因产物-DNA整合到染色体DNA上 某种胁迫条件下合成six基因产物-DNA脱离细菌染色体溶菌,62,（二）构建依据 1、噬菌体是一种温和噬菌体 2、能承载较大的外源DNA片段 野生型DNA头部可包装约36.451kb(自身的75%105%)，且约有20kb DNA可缺失（生长非必需） 3、在DNA上有多种限制性内切酶位点,63,（三）构建的基本策略与技术路线 策略: 切去部分非必需区 删掉多余的限制性内切酶位点 插入选择性标记基因 建立体外包装系统,64,技术路线 1、用限制性酶切去非必需区，抹去多余识别位点 选定一种酶，以gtWES 为例，EcoRI （48.5kb） DNA E co R I 6个片段,65,B片段是噬菌体生长非必需的； C片段缺失可阻断溶原生长途径，但不影响溶菌途径； E片段去掉min5序列（2.6kb）。 两端EcoR I别点经点突变或甲基化处理，即得gtWES：（48.5-5.5-2.6 = 40.4kb） 克隆能力： 替换B： 最大：51-(40.4-4.9)=15.5kb 最小：36.4-(40.4-4.9)=0.9kb 实际应用时克隆能力略有出入（p109,表3-5）,66,2、在DNA的非必需区内插入选择标记基因 （1）自然筛选（51kb或36.4kb不能包装） （2）插入选择标记基因 取代red和gam基因 野生型噬菌体(Spi+表型) 在P2噬菌体溶原性细胞中不能生长 （red、gam基因） 外源DNA取代 获Spi-表型 在P2噬菌体溶原性细胞中能生长 red、gam基因 局限性：只能以P2噬菌体溶原细胞作为受体 最常用的筛选标记：Lac Z基因,67,3、建立重组DNA分子体外包装系统 体外重组DNA分子必须经体外包装成噬菌体颗粒后，才能转导受体细胞。 野生型噬菌体感染的细胞中无多余的外壳蛋白。( 见教材解释：新版p115) D-（D基因缺失噬菌体）受体细胞积累除D蛋白以外所有蛋白质 E-（E基因缺失噬菌体）受体细胞积累除E蛋白以外所有蛋白质 混合 D、E互补 包装DNA分子 噬菌体 如:菌株BHB2688(E- )+ BHB2690(D-),68,（四） 噬菌体克隆载体的应用 1、建立c DNA基因文库 转导(transduction)由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程。效率高。 转染(transfection) 指真核细胞主动或者被动导入外源DNA 片段而获得新表型的过程。 2、克隆外源目的基因,69,（五）重组DNA分子的体外包装（自学）,1、溶原菌BHB2688(E- )和BHB2690(D-)的检验 2、制备包装物 3、体外包装,70,（一）构建策略 由质粒和含cos位点的DNA片段组装成的载体，即cosmid克隆载体,又叫粘粒; 或：cosmid克隆载体是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。是噬菌体质粒混合物。,二、cosmid克隆载体（柯斯质粒载体）,71,（二） cosmid的特征 (教材新版p118) 1、环形双链DNA分子, 36.4kb, 一般10kb 2、具有质粒的性质，可转化大肠杆菌，并按质粒方式复制 3、含有一个cos位点 A蛋白 cos末端体外包装成为噬菌体，但不含噬菌体溶菌生长途径、溶原生长途径和DNA复制系统，不会产生子代噬菌体,72,4、cosmid较小，可承载更大的外源DNA 若cosmid为6.5kb，则可承载44.5(51-6.5)kb外源DNA，且能被包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。 因此，cosmid克隆广泛用于构建基因组文库。,73,（三）柯斯克隆(Cosmid cloning),(1)定义 应用柯斯质粒作载体，在大肠杆菌寄主细胞中克隆大片段的真核基因组DNA的技术，叫做柯斯克隆。 这个定义的三个要点是： a.柯斯质粒作载体； b.大肠杆菌为寄主; c.克隆大片段的真核基因组DNA。,74,（2）理论依据,a.在phage线性DNA分子的每一端都具有彼此互补的单链突出序列，即所谓的粘性末端(cos位点) b.phage的多连体分子是由cos连接而成的。 cos cos cos cos cos cos c.末端酶(treminase)或叫Ter体系即phage具有一种位点特异的切割体系(site-specific cutting system).A蛋白 *此系统能识别两个相距适宜的(36.451kb)cos位点，并切割之。 *根据上述分析可知phage DNA包装的两个必要条件是：cos位点、Ter体系（A蛋白）,75,（3）柯斯质粒包装条件,由于只有在被作用的DNA分子具有两个cos位点，而且它们之间距离保持在36.451kb的条件下，Ter体系才能对它发生作用。 据此推断： 柯斯质粒是不能作为包装体系的，因为它只有一个cos位点。 因此：柯斯质粒只有在同适当大小的外源DNA片段重组成具有两个cos位点而且相距达36.451kb之间时，才能被包装。(见应用新版p119),76,利用Cos质粒进行克隆,77,（四）使用cosmid载体的基本程序 利用cosmid的质粒性质，可按质粒操作转化受体细胞 利用cosmid的噬菌体性质转导受体细胞（下图）,78,三、M13噬菌体克隆载体（单链丝状噬菌体载体 ）,79,含复制起始位点及可插入外源DNA的位点,（一）M13 DNA 环状单链DNA分子（“+”链DNA） 大小：6.4kb 结构：10个区 基因间隔区（IS区）,80,（二）M13DNA复制和M13噬菌体增殖 M13 DNA“+”链进入雄性大肠杆菌 合成“-”链产生双链M13 DNA复制型DNA(RF-DNA 按环状双链DNA方式复制，同时以“+”链DNA为模板转译包装蛋白 RF-DNA达200拷贝时，单链DNA特异结合蛋白与“+”链结合而阻断合成“-”链 结果只能以“-”链为模板合成“+”链 “+”链DNA被包装蛋白包装成新的M13噬菌体 挤出受体细胞 受体细胞不被溶菌。,81,82,83,M13 DNA复制特征：以双链DNA为中间媒介 培养物高速离心上清中含噬菌体颗粒“+”链DNA 沉淀菌体破碎后，可提取RF-DNA,84,（三）M13噬菌体克隆载体的构建策略和途径 策略：在RF-DNA的IS区插入选择标记基因，并组装合适 RF-DNA上有10个BsuI位点部分酶切获得全长线形RF-DNA, 与含LacZ标记的Hind酶切片段进行平末端连接M13mp1载体。为获得合适的克隆位点,可在Lac Z区插入连杆 构建成对M13载体，保证外源DNA两条链都能随“+”链一起复制包装。,85,86,（四）M13克隆载体的优点与应用 优点： 1、以双链环形DNA为中间媒介复制，可与质粒一样体外纯化操作 2、制备的M13 DNA单、双链都能转化大肠杆菌，直接转染受体细胞 3、单链DNA不受包装限制，可包装M13 DNA分子6倍的DNA分子 4、可产生大量纯化的含外源DNA插入的单链DNA分子 主要用途：克隆、分离单链外源DNA片段 获得的“+”链可直接用于DNA测序,87,MCS连杆,88,89,90,91,第三节 染色体定位整合克隆载体,质粒与病毒克隆载体的不足： 1、外源DNA的不稳定性 2、外源DNA插入染色体DNA位点的随机性,92,基因整合平台系统基因定位同源重组(基因打靶) 整合平台：即受体细胞基因组上给定的DNA区域，是外源DNA 定位整合的位置 定位整合克隆载体：除一般质粒克隆载体必备的元