超高效液相色谱-串联质谱法分析鸡蛋中利巴韦林及其代谢物残留.pdf

第 4 4卷 2 0 1 6年 6月 分析化学 ( F E N X I H U A X U E) 研究报告 C h i n e s e J o u r n a l o f A n a l y t i c a l C h e mi s t r y 第 6期 9 239 28 DOI ： 1 0 1 1 8 9 5 j i s s n 0 2 5 3 - 3 8 2 0 1 5 0 9 2 5 超高效液相色谱- 串联质谱法 分析鸡蛋中利 巴韦林及其代谢物残留 齐 凯 ， 汤晓艳 王 敏 郑 锌 杨梦瑞 周 剑 ( 中国农业科学院农业质量标准 与检 测技术研究所 ， 农业部农 产品质量安全重点实验室 ， 北京 1 0 0 0 8 1 ) ( 南京农业大学国家肉品质量安全控制工程技术研究中心， 南京 2 1 0 0 9 5 ) 摘要建立 了超 高效 液相色谱一 串联质谱法 同时快速 测定 鸡蛋 中利 巴韦林及其两种主要代谢 物 T C O N H 和 R T C O O H的分析检测方法。样品采用乙腈一 水( 9 ： 1 ， ) 提取， 乙腈饱和正己烷除脂， c 。 结合 G C B进行固相 分散萃取除杂 ， A g i l e n t Z O R B A X S B A q色谱柱( 1 0 0 m m x 3 0 m m， 1 8 m) 分离， 超高效液相色谱一 串联质谱 测定 。结果表 明 ： 利 巴韦林 、 T C O N H 和 R T C O O H分别在 2 0 2 0 0 IX g L ， 0 5 2 0 0 g L ， 5 0 2 0 0 g L浓 度范 围内 ， 线性 良好 ， 相 关系数 0 9 9 ， 检 出限分别 为 0 5 4 ， 0 0 9和 1 5 4 Ix g L ， 定量 限分别 为 1 7 9， 0 3 1 和 5 1 3 L 。在 5 0， 1 0 0和 5 0 0 g L加 标 水 平 下 ， 利 巴 韦林 和 R T C O O H 回收 率 分 别 为 9 6 1 9 9 6 和 4 2 9 一5 8 3 ； 在 0 5 ， 2 0和5 0 g L加标水平下， T C O N H 2 的回收率为 7 5 9 一1 0 6 7 ， 相对 标准偏差均为4 2 1 2 7 。实际样品测定结果表明， 本方法操作简单、 快速、 准确， 能够满足鸡蛋中利巴 韦林及其两种主要代谢物的分析检测。 关键词超高效液相色谱一 串联质谱；利巴韦林及其代谢物；鸡蛋 1 引 言 我国是禽蛋生产和消费大 国， 禽蛋产量多年来位居世界第一。禽类养殖过程 中禽流感 以及一些病 毒性疾病一直是困扰养殖户的头等问题 ， 为 了减少损失 ， 人用抗病毒药物利巴韦林 曾被用于兽医临床用 途。利巴韦林 ( 1 B D r i b o f u r a n o s y l 一 1 ， 2， 4 - t fi a z o l e 一 3 一 c a r b o x a mi d e ) 是一种人工合成的广谱抗病毒药物 ， 在动物 细胞 内被 迅速代谢 为 T C O N H 2 ( 1 ， 2 ， 4 - t fi a z o l e 一 3 一 c a r b o x a m i d e ) 和 R T C O O H( 1 - D r i b o f u r a n o s y l 一 1 ， 2 ， 4 - t fi a z o l e 一 3 一 c a r b o x y l i c a c i d ) 等相关代谢产 物 j ， 利巴韦林及其两种主要代谢物化学结构 式见 图 1 。但利 巴韦林具有一定 的毒副作用 ， 长期使用可使病毒产生不同程度的耐药性 ， 诱 导新型耐药病毒的出现， 从而影 响人类病毒疾 病的防治 ， 给人们 的身体 健康造 成危 害。因 此 ， 我 国农业 部于 2 0 0 5年发 布第 5 6 0 号公 告 ， 明确规定禁止在动物养殖过程 中使用利巴 韦林等人用抗病毒药物 。产业调研发现 ， 在 我国禽类养殖过程 中， 违规使用利 巴韦林等抗 病毒性药物现象 目前仍然十分严重 ， 严重威胁 禽类产品质量安全 。因此有必要建立快速 、 准 确 、 灵敏 、 高效的利 巴韦林及其代谢物残 留检 测方法 ， 为监管提供强有力的技术支撑。 目前 ， 检测利 巴韦林原型的方法有高效液 相色谱法 ( H P L C) 、 放射免疫法 ( R I A) L 6 、 TCONH， RTC00H H 图 1 利 巴韦林 、 T C O N H ： 和 R T C O O H的化 学结构式 Fi g 1 Ch e mi c a l s t r u c t ur e s o f r i b a v i r i n，1， 2， 4- t r i a z o l e 一 3一 c a r bo x a mi d e( T C O N H 2 )a n d 1 一 D fi b o f u r a n o s y l 一 1 ， 2 _ 4 一 t fi a z o l e 一 3 一 c a r b o x y l i c a c i d( R T C O O H) 2 0 1 5 1 1 1 7收稿 ； 2 0 1 6 - O 1 1 2接受 本文系“ 十二 五” 国家科技支撑计划项 目( N o 2 0 1 2 B A D 2 8 B 0 3 ) 和中国农 业科学 院科技创新工程项 目资助 E- ma i l ： t x y c a a s 1 2 6 c o n 分 析 化 学 第 4 4卷 毛细管电泳法( H P C E ) 7 1 、 液相色谱 串联质谱法 ( H P L C MS ) 等， 目标分析物主要涉及人血浆 和动 物源性食 品。对于利 巴韦林及其代谢 物的检测 ， 仅在动物血浆上有报道 ， 鸡蛋 中利 巴韦林及其代谢 物的残 留检测尚无相关报道。本研究采用超高效液相色谱 串联质谱法( U P L C MS MS ) 测定鸡 蛋中利 巴韦林及其两种主要代谢物 T C O N H ， 和 R T C O O H的残留量 ， 比较 了不同前处理方法， 优化 了超高效液 相色谱和质谱条件 ， 同时进行了方法学评估 ， 并应用于阳性鸡蛋样 品中 3种残留物检测分析。本方法操 作简单 、 快速 、 准确 ， 能够满足鸡蛋中利 巴韦林及其主要代谢物的残留检测。 2 实验部分 2 1 仪器 与试剂 A C Q U I T Y U P L C超高效液相色谱( 美 国 Wa t e r s 公 司) ； Q T R A P 6 5 0 0型三重四极杆一 线性离子阱复 合质谱系统 ( 美 国 A B S C I E X公司) ； 1 T r L D C I I 型氮气浓缩仪 ( 北京 同泰联科技 发展有 限公司 ) ； M i l l i Q 超纯水器( 美国 Mi l l i p o r e公司) 。 利巴韦林标准品( 德国 D r E h r e n s t o ff e r 公 司) ， 纯度 9 9 9 ； “ C 一 利 巴韦林标准品( 加拿大 T R C公 司) ， 纯度 9 9 9 ； 甲醇( H P L C级 ， 德 国 ME R C K公司) ； 甲酸 、 正己烷 ( H P L C级 ， 美 国 MR E D A公 司) ； 乙 腈( H P L C级 ， 美国J T B a k e r 公司) ； 实验用水为 Mi l l i - Q超纯水。 生鲜鸡蛋为本实验所用鸡蛋均为实验饲养蛋鸡所产 ， 其 中给药组为对蛋鸡连续 3天饲喂 3 0 mg k g 利巴韦林原药 ， 停药 1 ， 2 ， 5和 7天后采集的鸡蛋样品。 2 2标准溶液配制 分别用甲醇配制浓度为 1 0 0 m g L的利 巴韦林 、 T C O N H： 和 R T C O O H标准储备液 ， - 2 0 避光保存 。 移取 0 1 mL利 巴韦林 、 T C O N H ， 和 R T C O O H标准储备液混合 ， 用空 白鸡蛋提取净化液稀释成 1 0 m g L 混合基质标准溶液 ， 然后逐级稀释配制成 0 5 ， 1 0 ， 2 0 ， 5 0 ， 1 0， 2 0 ， 5 0 ， 1 0 0和 2 0 0 L共 9种不 同浓 度梯度基质标准溶液。 2 3样 品处理 准确称取鸡蛋液样品 1 0 g ( 精确至0 0 1 g ) 置于 5 0 m L具塞离心管中， 加入 2 0 0 L ” C 一 利 巴韦林 标准溶液 1 0 0 tx L作为 内标 ， 加入 1 0 mL乙腈一 水( 9 ： 1 ， ) 提取 ， 5 0 0 0 r m i n离心 1 0 mi n ， 转移上清液 至 5 O m L离心 管 中。 在上清液 中加入 5 m L乙腈饱和的正 己烷进行除脂 ， 5 0 0 0 r m i n离心 5 m i n ， 取下层溶液 5 mL于 1 0 m L离心管 中， 加入 固相萃取填充料石墨化碳 黑 ( G C B ) 和 c 各 5 0 mg进行净化 ， 5 0 0 0 r mi n离 fl , 5 mi n ，取上清液氮气吹干 ， 加 1 m L纯水复溶 ， 过 0 2 2 m滤膜后 ， 采用 U P L C MS MS测定。 2 4色谱条件 色谱柱 ： A g i l e n t Z O R B A X S B A q柱( 1 0 0 mmx 3 0 mm， 1 8 m) ； 流动相 ： A为 0 1 ( v v ) 甲酸溶 液 ， B相 为甲醇 ； 柱平衡时间 1 m i n ； 梯度洗脱程序 ： 02 5 m i n ， 9 9 A； 2 5 4 0 mi n ， 8 5 A； 4 0 5 0 ra i n ， 1 0 A； 5 1 8 0 mi n ， 9 9 A； 流速 0 3 mL m i n ； 进样体积 5 ；内标法定量。 2 5 质谱条件 离子源 ：电喷雾离子源( E S I ) ； 检测方式 ：多重反应监测 ( MR M) ； 扫描方式 ：正离子扫描 ； 碰撞气 ( C A D) 压力为 1 3 8 k P a ； 气 帘气 ( C MR) 压力 为 1 7 2 4 k P a ； 雾化气 ( G S 1 ) 压 力为 2 0 6 8 k P a ； 干燥 气 ( G S 2 ) 压力为 1 9 MP a ； 电喷雾电压( I S ) 为 5 5 0 0 V； 离子化温度( T E M) 为 5 5 0 C； MR M定量离子对、 去簇 电压 ( D P ) 及碰撞电压( C E) 见表 1 。 3结果与讨论 3 1 提取溶剂的选择 利巴韦林 属 于强极 性化 合物 ， 化 学结 构 中包 含 酰胺基 、 羟基 等基 团 ， 其 油水 分 配系 数 l g P 为 _ 2 0 6 ，易溶于水和 乙腈 、 甲醇等有机溶剂。 目前 ， 针对动物组织 中利巴韦林 的提取剂主要有0 1 第 6期 齐 凯等： 超高效液相色谱一 串联质谱法分析鸡蛋中利巴韦林及其代谢物残留 9 2 5 表 1 利巴韦林 、 T C O N H 、 R T C O O H及” C 利巴韦林质谱参数 T a b l e 1 O p t i ma l p a r a me t e r s a n d s e l e c t e d f r a g me n t i o n s f o r r i b a v i r i n，T C ONH2 ，RT C OOH a n d ”C 5 r i b a v i r i n 注 ： 为定量离子对 ( Q u a n t i t a t i v e i o n ) 。 甲酸- 乙腈溶液 ( 1 ： 9 ， v v ) 、 0 1 甲酸- 2 0 mm o l L乙酸铵 甲醇溶液( 1 ： 9 ， ) 和乙腈 水 ( 9 ： 1 ， ) 等 。本实验 比较 了上 述 3种 提取剂 的提取 效果。结果表 明， 0 1 甲酸 乙腈溶液 ( 1 ： 9 ，v v ) 和 0 1 甲酸- 2 0 mm o l f L乙酸铵 甲醇溶液( 1： 9 ，wv ) 对利 巴韦林及其代谢物并未达到理想 的提取效果 ， 且基质响应明显增大 ， 而乙腈一 水( 9 ： 1 ， ) 对 目标物具有很好 的提取效果 ， 且基质效应较前两者明显 变小 。分析原 因， 可能是酸性的提取液会对鸡蛋基质 中具有与利巴韦林及其代谢物相似基 团和结构 的 物质进行提取 ， 从 而导致 质谱 中基质 响应 变大 ， 影 响 目标物分 析 ， 故本实验采 用 乙腈一 水 溶液 ( 9： 1 ， ) 作为提取剂 。 3 2净化条件的选择 目前 ， 对于生物组织及体液 中利 巴韦林 的净化方式主要用固相萃取技术( S P E) ， 采用磺酸基强阳离 子( MC X) 萃取柱 、 氨基 ( N H ) 萃取柱 、 苯硼酸基弱阳离子 ( P B A) 萃取柱和亲水亲脂平衡 ( H L B) 萃取柱 等 。本方法应用 Q u E C h E R S快速样品前处理方法原理 ， 采用 乙腈饱和的正己烷去除溶于提取液 中的 油脂 ， 用 固相分散萃取填料除去脂溶性 的杂质和色素等。实验中考察 了 3种 固相萃取柱填料 丙基乙 二胺( P S A) 、 C 和 G C B对利巴韦林及其主要代谢物 回收率 的影响 ， 如图 2所示。结果表明， P S A对利巴 韦林有较大的吸附作用 ， 回收率在 7 6 7 9 之间， 而 c 和 G C B对利巴韦林 的吸附作用较小 ， 回收率 分别在 8 8 9 7 和 9 9 1 0 0 。分析原因发现 ， P S A在吸附基质中的色素、 有机酸等生物分子时 ， 对利巴韦林也产生了吸附作用 ， 导致回收率偏低 。因此 ， 本研究选用 C 和 G C B用于 固相萃取净化。此 外 ， 本方法与文献 1 6 报道 的利 巴韦林传统 固相萃取法进行 了比较 ， 结果表明 ， 采用本方法净化时 ， 利 巴韦林及其代谢物 的回收率均高于 固相萃取法 ， 且 重复性好 ， 净化时间缩短 ， 成本降低 。 3 3 色 谱- 质谱 条件 的选 择及 优化 利巴韦林属于强极性化合物 ， 在 c 柱上保 留性 差。本实验采用能分离极性化合物的 A g i l e n t Z O R B A X S B A q色谱柱 ( 1 0 0 m inx 3 0 mm，1 8 m) 进行 分离 ， 发现利 巴韦林在 3 0 6 m i n处出峰 ， 与 R T C O O H 达到了有效分离 ， 与代谢物 T C O N H 分离度不够 ， 但 利巴韦林和 T C O N H 在后续质谱 中电离生成 的特征 碎片离子对不 同( m z 2 4 5 1 1 3和 m z 1 1 3 9 6 ) ， 根据 不同特征离子对的质荷 比即可准确定量利 巴韦林原 型和代谢物 T C O N H 。利巴韦林是核苷类似物 ， 由于 鸡蛋基质 中含有大量的与利 巴韦林及其代谢物分子 c1 8 GCB 图2 P S A、 C 和 G C B固相萃取材料对利 巴韦林 、 T C O N H2 和 R T C O O H回收率的影响 F i g 2 Re c o v e rie s o f r i b a v i r i n 、 T C ONH2 a n d RT CO OH us i n g PS A ， C1 8 a n d GCB s o l i d p ha s e ma t e r i a l s 量相同的核苷类似物 ， 导致在提取 的过程中， 与 目标物一同提取出来 。这种基质在质谱 中响应影 响大 ， 用 目前 的萃取方法难以除去 ， 所以本实验采用液相色谱将基质与 目标物进行 了很好的分离 ， 从而消除基 加 舳 加 O 一 一 夸 A 【J g 9 2 6 分 析 化 学 第 4 4卷 质的影响。实验 中发现 ， 氮气吹干后的样品用 甲醇溶液复溶 ， 在同样 的仪器条件下 ， 利巴韦林及其代谢 物在色谱柱 中无保留， 均在 2 ra i n前出峰。且利 巴韦林及其代谢物和基质峰重合 ， 由于基质效应影响 大， 很难对结果进行有效分析。所以本实验中均采用超纯水对处理后的样品复溶 ， 基质在 4 2 ra i n处 出 峰， 与 3种 目标物达到了有效的分离 ， 保障了目标物准确 的定性和定量分析 。 本方法也同时考察了以0 1 甲酸 甲醇作为流动相时色谱柱对 目标物的分离效果。结果表 明， 在 流动相中甲醇的比例超过 3 0 时 ， 利巴韦林及其代谢物在色谱柱上的保 留性差 ， 有双峰出现 ； 随着甲醇 比例减少 ， 水相比例增加 ， 利 巴韦林峰形变好且与代谢物达到了有效分离； 将水相 比例维持在 9 9 进行 洗脱 ， 此时得到的利巴韦林峰形较好 ， 出峰时间有效避开 了基质峰 ， 排除了基质影响 ， 结果见图 3 。 B Ri ba v i r i n 八 图 3 鸡 蛋空 白基 质( A) 、 鸡蛋基质标准溶液 中的利 巴韦林 ( B ) 、 T C O N H ( C ) 和 R T C O O H( D) 的二级质 谱总离子流色谱图 F i g 3 MS MS t o t a l i o n c h r o m a t o a m o f b l a n k e g g( A ) ， r i b a v i r i n( B ) ， T C O N H 2 ( C )a n d R T C O O H ( D)i n ma t r i x s t a n d a r d s o l ut i o n o f bl a nk e g g 3 4线性范围、 方法检出限和定量限 为了消除基质效应对测定结果的影响 ， 本方法采用基质标准 曲线对利 巴韦林及其代谢物进行分析 ， 以定量离子对和内标 C 一 利巴韦林的峰面积 比为纵坐标 ( Y ) ， 以基质标准工作液浓度 ( 0 5 ， 1 0 ， 2 0 ， 5 0， 1 0 ， 2 0， 5 0， 1 0 0和 2 0 0 g L) 为横 坐标 ( X) 进行 线性 回归计 算。结果 表 明， 利 巴韦林 在 2 0 2 0 0 L 浓度范围内线性关 系良好 ， 线性方程为 y = 0 0 6 6 9 X+ 0 0 6 0 8 ( 相关系数 R 0 9 9 9 7 ) ； T C O N H 在 0 5 2 0 0 0 L浓度范 围内线性关系良好 ， 线性方程为 y =0 7 3 9 X + 3 7 9 ( 相关系数 R 0 9 9 3 1 ) ； R T C O O H在 5 0 2 0 0 0 L浓度范围内线性关系 良好 ， 线性方程为 l ， =0 0 1 8 1 X+ 0 0 1 9 2( 相关 系数 R 0 9 9 8 1 ) 。以信 噪 比 ( S N) 确定方 法 的检 出 限 ( L O D) 和 定量 限 ( L O Q) ， 得 到利 巴韦林 的 L O D ( S N= 3 ) 为 0 5 4 g L ， L O Q( S N=1 0)为 1 7 9 L ； T C O N H2的 L O D 为 0 0 9 L ， L O Q为 0 3 1 g L ； R T C O O H的 L O D为 1 5 4 g L ， L O Q为 5 1 3 L 。 3 5 方法的回收率和精密度 本实验采用在空白的鸡蛋 中添加标准溶液的方法进行添加 回收实验测定 ， 内标法校正， 每个浓度点 平行测定 6次 ， 其加标回收率及精密度结果见表 2 。 第 6期 齐 凯等 ： 超高效液相色谱一 串联质谱法分析鸡蛋中利巴韦林及其代谢物残留 9 2 7 表 2 利 巴韦林及其代谢 物测 定的回收率及相对标准偏差 T a b l e 2 Re c o v e r y a n d r e l a t i v e s t a n d a r d d e v i a t i o n o f r i b a v i r i n，T CO NH2 a n d RT C OOH 化合物 线性方程 C o mp o u n d Re g r e s s i o n e q u a t i o n 添加浓度 S p i k e d ( g L ) 检测值 F o u n d ( g L ) 回收率 Re e o v e J ( ， n =6 ) 精密度 RS D ( ， n ： 6) 利 巴韦林 R i b a v i r i n TC0NH 5 0 1 O O 5 O O O 5 2 O 5 O 5 O 1 O 0 5 0 O 4 8 5 9 6 2 4 9 8 0 O 5 3 1 9 4 3 8 O 2 8 6 5 8 3 21 4 9 6 9 9 6 1 9 9 6 1 O 6 7 9 7 0 7 5 9 5 2 7 5 8 3 42 9 5 5 4 8 4 2 1 2 7 4 2 7 7 1 2 3 6 4 1 0 1 3 6实际样品分析 应用本方法测定给药试验蛋鸡所产鸡蛋 中利 巴韦林原药及其代谢物 。经检测分析 ， 在停药 5天内， 鸡蛋样品中均检测出 3种物质利 巴韦林 、 T C O N H ， 和 R T C O O H， 其 中 T C O N H 残 留量远大于利 巴韦 林原 型 和 R T C O O H。随着停 药 时 间 延 长 ， 停 药 7天后 ， 鸡蛋 中均未检测到利 巴韦林原药和代谢 物 R T C O O H， 但 T C O N H 仍有残 留检 出， 结果见表 3 。根据鸡蛋中利 巴韦林及其代谢物残 留消除的 规律 ， 确定较长时间段 内残 留在鸡蛋组织 中的 目 标物为 T C O N H ， 可作 为蛋鸡养殖 中监察违规使 用利 巴韦林的重要依据 。 4 结 论 表 3 阳性样 品中利 巴韦林及其代谢 物分析 T a b l e 3 De t e r mi n a t i o n r e s u l t o f r i b a v i r i n a n d i t s me t a b o l i t e s i n po s i t i v e s a mp l e s 停药时间 坌堑 室 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! T i m e ( d ) R i b a v i r i n T C O N H2 R T C O O H 建立了超高效液相色谱- 串联质谱检测鸡蛋中利巴韦林及其主要代谢物残 留的方法 ， 针对利 巴韦林 在组织 中残 留量低 ， 转化率高的特点 ， 分析 了利巴韦林及其代谢物 T C O N H 、 R T C O O H在鸡蛋 中的残 留 情况。本方法很好地分离了利巴韦林及其代谢物和基质 中的核苷类似物 ， 消除 了基质效应影响。实验 中样品进样分析时间短 ， 操作简单 ， 分离度好 ， 回收率高 ， 定量限和精密度基本满足要求 ， 为实 际禽类养 殖 中利 巴韦林的监管提供 了有效的方法支撑。 Re f e r e n c e s 1 B o s c h M E， S a n c h e z A J R， R o j a s F S ， o j e d a C B 0 肌B i o m e d A n a 1 ， 2 0 0 7 ， 4 5 ( 2 ) ：1 8 5 - 1 9 3 2 E n d r e s C J ， Mo s s A M， K e B， G o v i n d a r a j a n R， C h o i D S ， Me s s i n g R O， U n a d k a t J D P h a r ma c o 1 E x p T h e r ， 2 0 0 9 ， 3 29：3 8 739 8 3 Mi n i s t ry o f A g r i c u h r u e N o 5 6 0 B u l l e t i n o f t h e Mi n i s t r y ofA g r i c u l t r u e of t h e P e o p l e s R e p u b l i c of C h i n a 2 0 1 5 - 0 1 - 1 2 农业部中华人民共和国农业部公告第5 6 0号， 2 0 1 5 -01 1 2 4 D Av o l i o A，d e Ni c o l o A，S i mi e l e M，T u r i n i S ，Ag n e s o d D，B o g l i o n e L，Cu s a t o J ，Ba i e t t o L，C a r i t i G，C a l c a g n o A， S c i a n d r a M，Di P e r r i G，Bo n o r a S ， Ph a r mBi o me d A n a 1 ，2 0 1 2，6 6： 3 7 6 3 8 0 5 D Av o l i o A，I b a n e z A，S c i a n d r a M ，S i c c a r d i M ，d e Re q u e n a D G，B o n o r a S，Di P e r r i G C h r o ma t o g r B，2 0 0 6，8 3 5： 1 2 7-1 3 0 6 A u s t i n R K，T r e f t s P E， H i n t z M，C o n n o r J D， A n t i m i c r o b M F K A g e n t s C h e m o t h e r ， 1 9 8 3 ， 2 4 ( 5 ) ： 6 9 6 - 7 0 1 7 WANG Yo n g Z h o n g，Z HANG Gu o Do n g ，L U B u C h i n Ho s p Ph a r m ， ，2 0 0 1 ，1 ：1 2 1 3 汪永忠 ， 张国栋，吕 布中国医院药学杂志， 2 0 0 1 ， 1 ： 1 2 1 3 9 2 8 分 析 化 学 第 4 4卷 8 9 1 0 1 2 1 3 l 4 M e l e n d e z M，R o s a r i o O， Z a y a s B ，R o d r i g u e z J F P h a r mB i o m e d A n a 1 ， 2 0 0 9， 4 9 ( 5 ) ： 1 2 3 3 1 2 4 0 Ye h L T，Ng u y e n M ，Li n C C C hr o ma t o gr S c i ，20 03，41：2 552 6 0 U F e i DI NG Li C h i n 】 Me d I ， 2 0 1 1 8 3 5 3 2 3 5 3 3 吴 飞 ， 丁 黎 医学信息 ( 中旬刊 ) ， 2 0 1 1 ， 8 ： 3 5 3 2 3 5 3 3 WANG We i Xi a S h a n d o n g_， An i m Hu s& V e t e Me d ，2 0 1 3，7：8 9 王维霞山东畜牧兽 医， 2 0 1 3 ， 7 ： 8 - 9 Y e h L T， N g u y e n M， D a d g o s t a r i S ， B u W，L i n C C P 0 B i o m e d A n a 1 ， 2 0 0 7 ， 4 3 ( 3 ) ：1 0 5 7 1 0 6 4 Z H U Y o n g L i n ， S H A O D e J i a ， J I A N G T i a n M e i ， L U G u i P i n g ， wu Q i o n g C h i n V e t e r i n a r y D r u g ， 2 0 0 8 ， 7 ： 2 2 2 5 朱永林 ， 邵德佳 ，蒋天梅 ， 陆桂萍 ，吴 琼中国兽 药杂志 ， 2 0 0 8 ， 7： 2 2 2 5 Z HU We i Xi a ，YANG J i Z h o u，YUA N P i n g ，S UN C h u a n L i a n，WANG Ca i J u a n ，S UN Wu Yo n g ，ZHAN G S h u S h e n g C h i n e s e J o u r n a l o f C h r o m a t o g r a p h y ， 2 0 1 3 ，1 0： 9 3 4 9 3 8 祝伟霞， 杨冀州，袁 萍， 孙传莲，王彩娟， 孙武勇 ， 张书胜色谱 ， 2 0 1 3 ， 1 0 ： 9 3 4 9 3 8 J Ji W K，L u o S Y， L i S Y， At h i l l L，Wu A，Ra y T，Z h o u W ，K e J ，S mi t h H T，T s e F L S J C h r o ma t o g r B， 2 0 0 7， 8 4 6 ( 1 2)：5 7 6 8 B e r e n d s e n B J A， We g h R S ， E s s e r s M L ， S t o l k e r A A M， We i g e l S A n a 1 B i o a n a 1 C h e m ， 2 0 1 2 ， 4 0 2 ( 4 ) ： 1 6 1 1 1 6 2 3 An a l y s i s o f Ri ba v i r i n a nd I t s M e t a b o l i t e s i n Fr e s h Eg g s by Ul t r a Hi g h Pe r f o r ma nc e Li q ui d Chr o m a t o g r a p hy - Ta nde m M a s s Sp e c t r o me t r y Q I K a i ， T A N G X i a o Y a n ， WA N G M i n ， Z HE N G X i n ，Y A N G Me n g R u i ， Z H O U J i a n ( K e y - L a b o r a t o r y of A g r if o o d S a f e t y a n d Q u a l i t y ， Mi n i s t r y of A g r i c u l t u r e ， I n s t i t u t e of Q u a l i t y S t a n d a r d s a n d T e s t i n g T e c h n o l o g y f o r A g r o - p r o d u c t s ，C h i nes e A c a d e m y of A g r ic u l t u r a l &S c i e n c e ， B e r i n g 1 0 0 0 8 1 ，C h i n a ) ( N a t i o n a l C e n t r e o fMe a t Q u a l i t y a n d S a f e t y C o n t r o l ， N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ， N a n fi n g 2 1 0 0 9 5 ，C h i n a ) Ab s t r a c t A r a p i d a n d c o n v e n i e n t u l t r a h i g h p e rfo r ma n c e l i q u i d c hr o ma t o g r a ph y t a n d e m n l a s s s pe c t r o me t r y ( U P L C MS MS )m e t h o d f o r a n a l y s i s o f r i b a v i r i n a n d i t s t w o m a i n k i n d s o f me t a b o l i t e s ，l ， 2 ， 4 一 t r i a z o l e 一 3 一 c a r b o x a m i d e( T C O N H2 )a n d 1 一 D r i b o f u r a n o s y l 一 1 ， 2 ， 4 一 t r i a z o l e 一 3 一 c a r b o x y l i c a c i d( R T C O O H) ， i n f r e s h e g g s h a s b e e n d e v e l o p e d a n d v a l i d a t e d T h e s a m p l e w a s e x t r a c t e d w i t h a c e t o n i t r i l e w a t e r( 9 ： 1 ， ) ，a d d e d N h e x a n e t o mo v e l i p o s o l u b l e s u b s t a n c e s ，a f t e r c e n t r i f u g a t i o n，t h e u p pe r s o l v e n t wa s c l e a n e d u p b y C l 8 a n d G C B，t h e n d e t e r m i n e d b y U P L C MS M S c o u p l e d w i t h A g i l e n t Z O R B A X S B A q c o l u m n( 1 0 0 m mx 3 0 mm， 1 8 t x m) O v e r t h e c o n c e n t r a t i o n r a n g e o f 2 0 2 0 0 0 L( 0 5 2 0 0 0 g L a n d 5 0 - 2 0 0 0 L )f o r r i b a v i r i n( T C O N H 2 a n d R