数字核酸扩增检测技术的研究与应用进展.pdf

第 4 4卷 2 0 1 6年 4月 分析化学 ( F E N X I H U A X U E ) 评述与进展 C h i n e s e J o u rna l o f An a l y t i c a l Ch e mi s t r y 第4期 51 25 21 D0I ： 1 0 1 1 8 9 5 j i s s n 0 2 5 3 - 3 8 2 0 1 6 0 1 2 0 数字核酸扩增检测技术的研究与应用进展 丁 雄 牟 颖 “ ( 浙江大学 工业控制技术国家重点实验室 分析仪器研究中心， 杭州 3 1 0 0 5 8 ) ( 浙江大学生命科学学院，杭州 3 1 0 0 5 8 ) 摘要近年来 ， 微纳尺度流体控制技术由于具备实现多相 、 多步和平行反应的优势 ， 已成为传统分析手段的 首选的补充和替代方法。其与核酸扩增方法的完美结合， 有效推动了数字核酸扩增检测 ( D i g i t a l n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n ， d N A D) 技术的建立与发展。作为可实现单分子水平检测的分析方法， d N A D技术已成为分子诊断领 域重要的组成部分。本文回顾了 d N A D技术的发展历程， 阐述了其检测原理，以及相 比于传统方法的优势 ， 对其最新研究 与应用 进展进行了综述 ， 并对其未来 的发 展进 行了展望 。 关键词微纳尺度； 微流控；数字核酸扩增检测； 数字 P C R； 流体控制 ； 综述 1 引 言 现代生物医学研究结果表 明， 对核酸生物标记物进行分析 ， 能有效监控与评估相关疾病 的发生 、 发 展与愈后 。核酸分析包括定性与定量分析两种 ， 尤其是定量分析， 对揭示疾病发生发展的分子机制 至关重要。作 为核 酸分 析 的未来 发 展方 向， 单分 子水 平 的数 字核 酸 扩增 检测 ( D i g i t a l n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n ， d N A D) 技术在现代生物 、 医学研究及诊断领域中的应用备受关注。 目前， 常规或“ 金标准” 的核酸分析技术是聚合酶链式反应 ( P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ， P C R ) 。自 1 9 8 3年 ， P C R诞生以来 ， P C R及其衍生技术极大地推动了生命科学各个领域的发展。纵观整个发展历 程 ， P C R技术可分为 3个时代 。第一代 P C R， 使用琼脂糖凝胶电泳等方式对核酸扩增产物进行分析 ， 但操作繁琐、 易交叉污染 ，且只能进行定性分析 ； 第二代 P C R则是 由美 国 A B I 公 司推广的实时荧光定 量 P C R( R e a l t i me q u a n t i t a t i v e P C R， q P C R) 。作为新一代的 P C R技术 ， q P C R不仅能进行定性分析 ， 还能 进行定量分析 。根据定量策略的不同， 又分为相对定量和绝对定量。相对定量是以管家基因的表达量 为参照 ， 对待测基因表达量进行定量分析的策略， 常用于基 因表达水平分析 ； 绝对定量则是利用 以已知 核酸分子数的标准品与循环阈值 ( c ) 之间建立 的标准 曲线对未知样本 中核酸分子进行定量测定 的策 略。然而 ， 在 q P C R扩增 的过程中存在扩增偏好或易受抑制剂影响等因素 ， 其扩增效率在不 同样本 间难 以保持一致 ， 因此使得 c 在核酸定量分析过程中有明显偏差 ， 从而导致检测原始样本 的核酸数量 出现 明显误差 。采用 q P C R对核酸定量 ， 仍存在灵敏度 、 准确度和重现性欠佳 的不足 ， 难 以满足对稀有突变 基因的表达量 、 低拷 贝核酸量 的分析要求。鉴于此 ， 第三代 P C R即数字 P C R( D i g i t a l P C R， d P C R) 技术应 运而生。与前两代 P C R技术相 比， d P C R的测量精确度和灵敏度 明显提高 J ， 是真正意义上的绝对核酸 定量分析技术 。本文对 d N A D的研究与应用进展进行 了综述 ， 并对其发展历程 、 原理优势和未来发展 前景进行 了阐述和展望。 2 d NAD 的发展历程 作为一种开创性的定量分析技术， d P C R推动 P C R技术迈人了新的高度， 使核酸定量分析进入到以 “ 终点信号的有或无” 来计算数量的新阶段 。虽然其雏形早在 q P C R成熟之前就被提及 ， 但 d P C R的 概念却是由美国科学家 V o g e l s t e i n和 K i n z l e r 在 1 9 9 9年明确提 出 。就本质而言 ， d P C R就是通过大规 模 的平行荧光 P C R扩增 ， 将微弱的扩增信号从背景噪音 中精准地提炼 出来 。因此 ， 如何获得足够数 2 0 1 6 -02 2 3收稿 ； 2 0 1 6 - 0 3 - 1 8接受 本文系 国家 自然科学基金提供资助 ( N o 3 1 2 7 0 9 0 7 ， 3 1 0 7 0 7 7 2 ) E - ma il ：m u y in g z j u e d u C B 第 4期 丁 雄等 ： 数字核酸扩增检测技术的研究与应用进展 5 1 7 所示 。真空脱气时， S P C芯片中整个微型结构区域 内由于 P D MS的溶气性变成负压， 其可充 当引导液体 进入微腔室的动力源。当依次导入水相 ( 扩增液) 和油相 ( 密封液 ) ， 并根据微腔室数量控制好水相体积 时 ， 无需任何附属设备或微泵微 阀结构即可实现扩增液体的离散化。 G a n s e n等 制备了 s D芯片并应用于 d L A MP ( 图 3 F ) 。该芯片利用了流体压力与表面张力之间的 相互作用实现液体的自我分散。芯片在导入水相前预先充盈油相， 当注入水相时， 液体会在微腔室内 继分散 ， 形成个乳化液滴 。由于整个过程是基于液体 固有性质实现 的， 故进样无需任何外界控制装置。 但是 ， 随着水相液体不断分散 ， 其液滴体积逐渐变小 ， 以至于不能充盈整个微腔 。当然 ， 这种情况可以通 过耗损部分试剂使每个微腔充盈来弥补 。 5 d N AD 的应用 相对于传统核酸检测技术而言 ， d N A D可实现对核酸分子 的高灵敏度 、 高精准度、 高耐受性 的绝对 定量分析。目前 ， d N A D已被应用到生命科学及相关领域中， 如病原微生物的检测、 食 品安全、 临床诊断 ( 癌症超早期诊断和产前诊断) 和基因组学研究等。 5 1 病原微生物的检测 d N A D技术 已成为 目前病原微生物检测手段 中最灵敏 的技术之一 ， 可提供 准确 的疫情 和产 品评估 数据。董莲华等 针对大肠杆菌 O 1 5 7 ： H 7建立了液滴式 d P C R检测方法 。该方法 的定量动态范围广 ( 每 2 O L反应液中 41 2 5 1 0 拷贝) ， 且精密度高 、 特异性强 ， 对实际样本的检测结果与 q P C R一致。 K e l l e y等 采用 T a q M a n探针建立 了针对耐 甲氧西林金黄色葡萄球菌的多重液滴式 d P C R检测方法 ， 对 3 9 7份临床样本 的检测结果表明 ， d P C R方法与传统 q P C R测试结果一致。S t r a i n等。 加 的研究结果表明 ， 液滴式 d P C R可以作为 H I V病毒 D N A的精确的检测方法 ， 且灵敏度高 、 重复性好 。由于 d N A D利用 的 是样本离散化策略 ， 因此建立无核酸提取的病原检测方法也是其应用方 向之一。P a v 等 分别采用 Q X1 0 0液滴式 d P C R系统和 B i o m a r k HD I F C芯片式 d P C R系统建立针对人 巨细胞病毒 的无核酸提取 检测方法 ， 其检测结果与提取后 的方法完全一致。此外 ， d N A D的高灵敏度 同样也可被应用到与病原微 生物相关的研究中， 如抗 H I V病毒治疗评估_ 4 、 H I V和 HC V病毒耐药突变检测_ 4 以及环境微生物基 因水平 的连锁分析 等。 5 2 食品安全监测 食品安全检测主要涉及两方面：一是食源性微生物的检测 ； 二是转基因成分的鉴定。现有的食 品 安全监测中， 最常用的技术手段是 q P C R， 需构建标准 曲线来定量。而 d N A D方法无需标准物质 以及标 准 曲线 ， 大 大降低 了工作强度 。F u等 采用 B i o Ma r k H D I F C芯 片式 d P C R系统 成功建立 了针对 C a M V 3 5 s 启动子和 N O S终止子转基因成分的鉴定 ， 结果表明，该 d P C R能鉴别含量低 至 0 1 的转基 因成分 ， 低于欧盟的限定标准。D a l mi r a等 则采用液滴式 d P C R系统来鉴别玉米 的转基 因成分， 检测 限低至 0 0 8 。C a o等 和 C o u d r a y M e u n i e r 等 则分别采用液滴式 d P C R和芯片式 d P C R系统 ， 对水 源微生物肠球菌和诺如病毒( N o V ) 进行检测和监控， 结果精准、 可靠。F l o r e n 等 和 T ia n 等 。 。 则针对 食物掺假问题 ， 采用 d N A D平 台进行食 品检测。 5 3临床 诊 断 临床诊断是 d N A D技术的主要应用领域 ，它涉及范围广 ， 如个体化医疗应用( 无创或微创癌症超早 期分子诊断) 、 产检诊断等。众所周知 ， 临床样本如血液 、 尿液、 粪便等包含着很多无关核酸序列和反应 抑制剂。常规的 q P C R在进行分子诊断时 ， 很容易出现偏好扩增或扩增受抑制 的现象 ， 而 d N A D技术具 备强的耐受性 ， 能有效降低无关核酸序列对扩增的干扰 ， 实现对标记物的精确检测 。 开展无创或微创癌症超早期分子诊断是人性化医疗未来发展的趋势， 也使得基于d N A D平台的第 三方医学诊断技术 日趋成熟。 目前的研究热点包括针对肺癌相关的 E G F R、 B R A F和 K A R S基 因的单核 苷酸多态性 ( S N P ) 突变检测 卜 、 慢性骨髓 白血病 AB L酪氨酸激酶结构域位点突变检测 _ 5 、 乳腺癌的 HE R 2基因表达水平检测 卯 以及原癌基因调控区甲基化水平的检测等 _ 5 。Z h u等 _ 1 采用 S P C芯 片式 d P C R对 3种 与肺癌相关基 因 ( P L A U， E N O 2和 P L A T) 的 mR N A表达水 平进行 检测 ， 其 结果与 5 1 8 分 析 化 学 第 4 4卷 q P C R检测结果相 当。We i s e n b e r g e r 等 基于 I F C芯片式 d P C R系统对乳腺癌相关的 C p G基 因岛甲基 化水平进行 了系统的研究 ， 其结果表明 d N A D平台可实现单分子水平 的甲基化诊断。 与传统的产前 诊断方 法相 比， d N A D无需 活检穿 刺 ， 只需对 游离胎 儿 D N A( C e l l f r e e f e t a l D N A， c f f D N A) 进行相关分子检测即可预知孕情或胎儿状况。G u等 采用 Q x1 0 o液滴式 d P C R系统对 c f f D N A进行分析， 以评估 遗传性 甲基丙二 酸血症 的风 险。B a r r e t t 等 则采用 B i o m a r k HD I F C芯 片式 d P C R装置来评估胎儿镰状细胞性贫血症分型。 5 4基因组学研究 在基因组学研究 中， d N A D技术的作用就是对通过 N G S 、 微阵列杂交或全基因组关联分析研究等手 段获取的海量基因组信息的“ 情报” 确认， 充当着“ 放大镜” 的角色。此外， d N A D技术还可用于 N G S的 文库构建和结果校正 lj 。 拷贝数变异( C N V) 是基 因组学研究 的主要 内容 ， 而 d N A D技术在 C N V检测上有着独 特的优 势。 d N AD可直接获取 目标基因的绝对拷贝数 ， 提供准确的数据 ， 这是其它技术( 如 N G S ) 所难达到 的， 且成 本低 、 通量高。对于低丰度的 C N V， d N A D的检测 限( 低至 0 0 0 1 ) 大大低 于 q P C R( 一般 为 1 0 ) 和 N G S ( 一般为 1 ) 。B o e t t g e r 等 应用液滴式 d P C R系统来分析和评估人类基因组 1 区 l 7 q 2 1 3 1 基因 座内的复杂 C N V和 S N P现象 ， 以研究父母 系与后代之间基因组的关联性 。F u等 构建了液滴式数字 全基 因组扩增技术 ( d WG A) ， 实现单细胞水平的基因组测序 ， 该方法在分析 C N V和 S N P时扩增均一性 和结果精准度 明显提高。 6 总结与展望 d N A D技术是一种高灵敏度、 高准确度、 高辨识力、 高耐受性、 可实现绝对定量分析的核酸分子诊断 技术 ， 是现有核酸诊断技术的补充与飞跃 ， 其所具备 的应用优势必将大大推动生物学研究 、 临床诊断、 食 品安全和环境监测等领域的发展。同时 ， 它也预示着一个拥有巨大潜能的新兴产业和技术 。然而 ， 目前 的 d N A D技术仍处于待完善 阶段 ， 还存在许 多不足之处 。首先 ， 现有 d N A D装置的集成度不高， 如 B i o r a d的Q X l O 0 液滴式 d P C R系统由液滴发生器、 P C R扩增仪和液滴信号读取器 3 种设备配套组成 ， 仪器 成本高 ， 一般 的实验室难以承受 。已有研究团队 盯 尝试将细胞核酸提取 、 纯化功能与 d N A D结合集 成到微流控芯片上 ， 构建多功能数字化检测平台， 但是 目前 尚无成型商品。其次 ， 当 d N A D的通量增高 或者微单元体积缩小时 ， 现有信号采集的方法难以做到简便 、 快捷 、 准确 ， 常需要后期繁琐的信号处理与 分析过程 。此外 ， d N A D仍受到常规核酸扩增法所面临的扩增效率问题的影响 ， 即表现为如何保证微单 元的反应效率或优化微反应体系。最后， 现有 d N A D技术难以真正实现现场检测或 P O C T 。随着 d N A D 的不断发展 ， 这些 问题必定会得到有效解决 。总之 ， 基于微纳尺度流体控制的 d N A D技术为实现高灵 敏 、 高精度的核酸单分子水平分析提供了全新 的思路和手段 ， 未来有望成为新的“ 金标准” 技术 。 Re f e r e nc e s 1 C h e n Y， P e r k i n s M， T e i x e i r a L， C a v e M，E i s e n a c h K C l i n Mi c r o b i o 1 ， 1 9 9 8 ， 3 6 ( 7 ) ： 1 9 6 4 1 9 6 8 2 T o b a l K，Ne w t o n J ，Ma c h e t a M，Ch a n g J ，Mo r g e n s t e r n G，E v a n s P，Mo r g a n G，L u c a s G S，Yi n J L Bl o o d，2 0 0 0， 9 5( 3 )：8 1 5 8 1 9 3 Ga c k M U，Ki r c h h o f e r A，S h i n Y C，I n n K S，L i a n g C，C u i S，My o n g S，Ha T，Ho p f n e r K P，J u n g J UPr o c Na t 1 A c a d S c i ， 2 0 o 8 ， 1 0 5 ( 4 3 ) ： 1 6 7 4 3 1 6 7 4 8 4 J I N Y u L i a n g Mo d A g r i c S c i T e c h n o 1 ，2 0 1 2，1 0： 4 7 4 8 金宇良现代农业科技， 2 0 1 2 ，1 0： 4 7 4 8 5 Z H A N C h e n g ， Y A N L i ， WA N G L i n ， J I N Y u L i n ， C H E N L i ， S H I Y u ， WA N G Q u a F u d a n U n w Me d S c i ， 2 0 1 5， 4 2 ( 6 ) ： 7 8 6 - 7 8 9 詹 成， 燕 丽 ， 王 琳， 金玉麟 ， 陈 力，时 雨 ， 王 群复旦学报：医学版， 2 0 1 5， 4 2 ( 6 ) ： 7 8 6 7 8 9 第4期 丁 雄等： 数字核酸扩增检测技术的研究与应用进展 5 1 9 Z H U Q i a n g - We n ，Y A N G We n X i u ，G A O Y i - B o ，Y U B i n g - We n ，Q I U Hn ，Z H O U C h a o ，J I N We i ，J I N Q i n H a n ， MU Y i n g C h e m ， C h i n e s e U n i v e r s i t i e s ， 2 0 1 3 ， 3 4 ( 3 ) ： 5 3 8 - 5 4 4 朱强远， 杨文秀， 高一博，于丙文， 邱 琳，周 超， 金 伟 ， 金钦汉， 牟 颖高等学校化学学报， 2 0 1 3 ， 3 4 ( 3 ) ： 5 3 8 - 54 4 P e r k e l J MS c i e n c e ， 2 0 1 4 ， 3 4 4 ( 6 1 8 0 ) ： 2 1 2 2 1 4 V o g e l s t e i n B ，K i n z l e r K WP r o c N a t 1 A c a d S c U S A ， 1 9 9 9 ， 9 6 ( 1 6 ) ： 9 2 3 6 - 9 2 4 1 M e n Y，F u Y，C h e n Z， S i m s P A，G r e e n l e a f W J ， H u a n g Y A n a 1 C h e m ， 2 0 1 2 ， 8 4 ( 1 0 ) ： 4 2 6 2 4 2 6 6 S u n d b e r g S O， Wi t t w e r C T， G a o C ，G a l e B K A n a 1 C h e m ， 2 0 1 0 ， 8 2 ( 4 ) ： 1 5 4 6 - 1 5 5 0 S h e n F ，D u W， K r e u t z J E， F o k A， I s m a g i l o v R F L a b C h ip， 2 0 1 0 ， 1 0 ( 2 0 ) ： 2 6 6 6 - 2 6 7 2 P i n h e i r o L B，C o l e ma n V A，Hi n d s o n C M ，He r r ma n n J ，Hi n d s o n B J ，B h a t S，E ms l i e K RA n a 1 C h e m，2 0 1 1， 8 4 ( 2 ) ： 1 0 0 3 - 1 0 1 1 Z h u Q， Q i u L ，Y u B， x u Y， G a o Y， P a n T， T i a n Q，S o n g Q， J i n w ， J i n Q，M u YL a b C h p ， 2 0 1 4， 1 4 ( 6 ) ： 1 1 7 6 1 1 8 5 N o t o mi T， O k a y a ma H， Ma s u b u c h i H， Y o n e k a w a T ， Wa t a n a b e K， A m i n o N， H a s e T N u c l e i c A c i d s R e s ， 2 0 0 0 ， 2 8 ( 1 2 ) ： e 6 3 G a n s e n A，H e r r i e k A M， D i mo v I K， L e e L P， C h i u D T Lab C h p ， 2 0 1 2 ，1 2 ( 1 2 ) ： 2 2 4 7 - 2 2 5 4 Z h u Q， G a o Y，Y u B， R e n H，Q i u L， H an S ， J i n W， J i n Q，M u Y Lab C h ip， 2 0 1 2， 1 2 ( 2 2 ) ： 4 7 5 5 4 7 6 3 R a n e T D， C h e n L， Z e c H C， Wa n g T HLab C h ip， 2 0 1 5， 1 5 ( 3 ) ： 7 7 6 7 8 2 B l a i n e y P C， Q u a k e S R N u c l e i c A c i d s R e s ， 2 0 1 1 ， 3 9 ( 4 ) ： e l 9 Ma z u t i s L，Ar a g h i A F，Mi l l e r O J ，Ba r e t J C，F r e n z L，J a n o s h a z i A，T a l y V，Mi l l e r B J ，Hu t c h i s o n J B，L i n k D，G r i f - fi t h s A D， R y c k e l y n c k M A na1 C h e m ， 2 0 0 9， 8 1 ( 1 2 ) ： 4 8 1 3 - 4 8 2 1 D i n g X，Wu W， Z h u Q， Z h a n g T ，J i n W， M u Y A na1 C h e m ， 201 5 ， 8 7 ( 2 0 ) ：1 0 3 0 6 1 0 3 1 4 S c h u l e r F ， S c h w e m me r F ， T r o t t e r M， Wa d l e S ， Z e n g e r l e R， y o n S t e t l e n F ， P a u s t N Lab C h p ， 2 0 1 5 ， 1 5 ( 3 ) ： 2 7 5 9 2 7 6 6 K o n r y T， S mo l i n a I ，Y a r mu s h J M， I r i m i a D， Y a r m u s h M L S m a l l ， 2 0 1 1 ， 7 ( 3 ) ： 3 9 5 - 4 0 0 P o h l G， S h i h I ME x p e r t R e v Mo 1 D i a g n ， 2 0 0 4 ， 4 ( 1 ) ： 4 1 4 7 L I N C a i - Q i n ，Y A O B o P r o g C h e m ， 2 0 1 2， 2 4 ( 1 2 ) ： 241 5 2 4 2 3 林彩琴 ， 姚 波化 学进展 ， 201 2， 24 ( 1 2 ) ： 24 1 5 - 242 3 D e v o n s h i r e A S ， E l a s w a r a p u R， F o y C A B MC G e n o mic s ， 2 0 1 1 ， 1 2 ( 1 ) ：l 1 8 Mo r r i s o n T，Hu rl e y J ，Ga r c i a J ，Yo d e r K，K a t z A，R o b e r t s D，C h o J ，K a n i g an T，I l y i n S E，Ho r o wi t z D，D i x o n J M， B r e n a n C J N ucl e icA c i ds R e s ， 2 0 0 6， 3 4 ( 1 8 ) ：e 1 2 3 Hi n d s o n B J ，Ne s s K D，Ma s q u e l i e r D A，B e t g r a d e r P， He r e d i a N J ，Ma k a r e wi c z A J ，B rig h t I J ，L u c e r o M Y，Hi d d e s s e n A L，L e g l e r TC，K i t a n oTK，Ho d e l M R，P e t e r s e n J F， Wy a t t PW ，S t e e n b l o c kER，S h a h PH，B o u s s eL J ， T r o u p C B， Me l l e n J C，Wi t t ma n n D K，Er n d t N G，C a u l e y T H，Ko e h l e r R T，S o A P，Du b e S ，Ro s e K A，Mo n t e s c l a r o s L，Wa n g S L，S t u mb o D P，Ho d g e s S P，Ro mi n e S，Mi l a n o v i c h F P，Wh i t e H E，Re g a n J F，Ka r l i n - Ne u ma n n G A，Hi n d s o n C M， S a x o n o v S ， C o l s t o n B WA na1 C h e m ， 2 0 1 1 ， 8 3 ( 2 2 ) ： 8 6 0 4 - 8 6 1 0 He y r i e s K A，T r o p i n i C，Va n i n s b e r g h e M ，D o o l i n C，P e t r i v 0 I ，S i n g h a l A ，L e u n g K，Hu g h e s man C B，Han s e n C L N a t Me t h o ds ， 2 0 1 1 ， 8 ( 8 ) ： 6 4 9 6 5 1 C H E N J i u S h e n g 。 J I A N G J i a - H u a n C h i nes e， A na1 C h e m ， 2 0 1 2 ， 4 0 ( 8 ) ：1 2 9 3 - 1 3 0 0 陈九生， 蒋稼欢分析化学， 201 2 ， 4 0 ( 8 ) ：1 2 9 3 - 1 3 0 0 T a n a k a H， Y a m a m o t o S ， N a k a m u r a A， N a k a s h o j i Y， O k u r a N， N a k a mo t o N， T s u k a g o s h i K， H a s h i m o t o M A na1 C h e m ， 2 0 l 5 ， 8 7 ( 8 ) ： 4 1 3 4 4 1 4 3 L e n g X， Z h a n g W， Wa n g C，C u i L ， Y a n g C J L a b i P ， 201 0， 1 0 ( 2 1 ) ： 2 8 4 1 2 8 4 3 B e e r N R，Wh e e l e r E K，L e e - Ho u g h t o n L，Wa t k i n s N，Na s a r a b a d i S，He b e r t N，L e u n g P，Ar n o l d D W ，B a i l e y C G， C o l s t o n B WA na1 C h e m ， 2 0 0 8 ， 8 0 ( 6 ) ：1 8 5 4 1 8 5 8 Z h o n g Q，B h a t t a e h a r y a S ，K o t s o p o u l o s S ，O l s o n J ，T a l y V，G r i f fi t h s A D，Lin k D R，L a l o n J WLab C h i p ，2 0 1 1 ， 1 1 ( 1 3 ) ： 2 1 6 7 - 2 1 7 4 U n g e r M A， C h o u H P ， T h o r s e n T， S c h e r e r A， Q u a k e S R S c i e n c e ， 2 O O O， 2 8 8 ( 5 4 6 3 ) ：1 1 3 - 1 1 6 O t t e s e n E A， Ho n g J W， Q u a k e S R，L e a d b e t t e r J R S c ie n c e ， 2 0 0 6 ， 3 1 4 ( 5 8 0 4 ) ： 1 4 6 4 1 4 6 7 6 7 9 m n ” 加 勰 如 5 2 0 分 析 化 学 第 4 4卷 3 6 3 7 38 39 40 41 42 4 3 4 4 4 5 46 B h a t S ，H e r r m a n n J ， A r m i s h a w P ， C o r b i s i e r P ，E m s l i e K R A n a 1 B i o a n a 1 C h e m ， 2 0 0 9 ， 3 9 4 ( 2 ) ： 4 5 7 - 4 6 7 S u n B， S h e n F ，Mc C a l l a S E， K r e u t z J E， K a r y mo v M A， I s m a g i l o v R F A n a 1 C h e m ， 2 0 1 3 ， 8 5 ( 3 ) ： 1 5 4 0 1 5 4 6 DONG L i a n Hu a，Z HANG L i n g ，J 1 N G J u n，WANG J i a n g - Na n ，WAN G J i n g ，C HEN We i J u n C h i n e s e A n a 1 C h e m， 2 0 1 5 ， 4 3 ( 3 ) ： 3 1 9 3 2 4 董莲华，张 玲， 姜 君 ， 王江南， 王 晶， 陈唯军分析化学， 2 0 1 5 ， 4 3 ( 3 ) ： 3 1 9 3 2 4 K e l l e y K， C o s m a n A， B e l g r a d e r P， C h a p m a n B ，S u l l i v a n D C C l i n Mi c r o b i o 1 ， 2 0 1 3 ， 5 1 ( 7 ) ： 2 0 3 3 2 0 3 9 S t r a i n M C，L a d a S M ，L u o n g T，Ro u g h t S E，Gi a n e l l a S， T e r r y V H ，S p i n a C A，W o e l k C H ，R i c h ma n D DP l o S o ne ， 2 0 1 3 8 ( 4 ) ： e 5 5 9 4 3 P a v i c J ， 之 e l J ， Mi l a v e c MA n a 1 B i o a n a 1 C h e m ， 2 0 1 6 ， 4 0 8 ( 1 ) ： 1 0 7 1 2 1 K i s e l i n o v a M， P a s t e r n a k A 0， D e S p i e g e l a e r e W， V o g e l a e r s D， B e r k h o u t B， V a n d e k e r c k h o v e L P L o S O n e ， 2 0 1 4 ， 9 ( 1 ) ： e 8 5 99 9 S h e n F，S u n B，Kr e u t z J E，Da v y d o v a E K，Du W ，Re d d y P L，J o s e p h L J ，I s ma g i l o v R FJ AmC h e mS o c ， 2 0 1 1， 1 3 3 ( 4 4 ) ：1 7 7 0 5 1 7 7 1 2 T a d mo r A D， O t t e s e n E A， L e a d b e t t e r J R， P h i l l i p s R S c i e n c e ， 2 0 1 1 ， 3 3 3 ( 6 0 3 8 ) ： 5 8 6 2 F u W， Z h u P ，Wa n g C ，H u a n g K， D u Z， T i a n W， Wa n g Q， Wa n g H， X u W， Z h u S S c i R e p ， 2 0 1 5 ， 5 ： 1 2 7 1 5 D a l m i r a F U， Me l i n a P U， J o s 6 一 B e n i g n o V T， J o s e fi n a L F， R a y m u n d o G E， A b r a h a m A S A n a 1 C h e m ， 2 0 1 6 ， 8 8 ( 1 ) ： 8】 281 9 4 7 Ca o Y，Ra i t h M R，Gr i mt h J FWa t e r R e s ， 2 0 1 5， 7 0：3 3 7 3 4 9 4 8 Co u d r a y Me u n i e r C，F r a i s s e A，Ma r t i n - L a t i l S，Gu i l l i e r L，D e l a n n o y S，F a c h P， P e r e l l e S I n t Fo o d Mi c r o b i o 1 ， 20 1 5，201：1 7-26 4 9 F l o r e n C，Wi e d e ma n n I ，B r e n i g B，S c h t i t z E，B e c k J Fo o d C h e m， 2 0 1 5，1 7 3：1 0 5 4 -1 0 5 8 5 0 T i a n Q， Mu Y， X u Y， S o n g Q， Y u B ，Ma C ， J i n W， J i n Q A n a 1 B i o c h e m ， 2 0 1 5 ， 4 9 1 ： 5 5 5 7 5 1 Ma l a p e l l e U ，d e L u e a C，Vi g l i a r E，A mb r o s i o F，R o c c o D，P i s a p i a P，B e l l e v i e i n e C，T r o n e o n e G C l i n 。 Pa t h o 1 ， 2 0 1 6，p i i ：i e l i n p a t h - 2 0 1 5- 2 0 3 4 2 9 5 2 S i n g e r G，O l d t R，C o h e n Y，Wa n g B G， S i d r a n s k y D，K u r m a n R J ， S h i h I M N a t 1 C a n c e r l n s t ， 2 0 0 3， 9 5 ( 6 ) ： 48 4 48 6 5 3 S a n ma me d M F， F e r n a n d e z L a n d a z u fi S， Ro d r l g u e z C， Z a r a t e R， L o z a n o M D，Z u b i r i L， P e r e z Gr a c i a J L，Ma rt i n - Al g a r r a S ， G o n z 6 1 e z AC l i n C h e m ， 2 0 1 5 ， 6 1 ( 1 ) ： 2 9 7 - 3 0 4 5 4 T a l y V，P e k i n D ，B e n h a i m L，Ko t s o p o u l o s S K，L e Co r r e D，L i X，A t o c h i n I ，L i n k D R，Gr i ff i t h s A D ， P a l l i e r K，Bl o n s H，B o u c h 6 0， L a n d i B， H u t c h i s o n J B， L a u r e n t P u i g P C l i n C h e m ， 2 0 1 3 ， 5 9 ( 1 2 ) ： 1 7 2 2 1 7 3 1 5 5 O e h l e r V G，Q i n J ， R a ma k fi s h n a n R，F a c e r G，A n a n t h n a r a y a n S ， C u m mi n g s C ，D e i n i n g e r M，S h a h N，Mc C o r m i c k F ， Wi l l i s S ， D a r i d o n A， U n g e r M， R a d i c h J P L e u k e mi a ， 2 0 0 9 ， 2 3 ( 2 ) ： 3 9 6 - 3 9 9 5 6 G e v e n s l e b e n H ，Ga r c i a Mu r i l l a s I ，G r a e s e r M K，S c h i a v o n G，Os i n P，P a t t o n M ，S mi t h I E，As h w o r t h A ，T u rn e r N C i n C a n c e r R e s ， 2 0 1 3， 1 9 ( 1 2 ) ： 3 2 7 6 3 2 8 4 5 7 B e l g r a d e r P ， T a n n e r S C， R e g a n J F ，K o e h l e r R， Hi n d s o n B J ， B r o w n A S C l i n C h e m ， 2 0 1 3 ， 5 9 ( 6 ) ： 9 9 1 9 9 4 5 8 We i s e n b e r g e r D J 。 L i a n g GT r a n s 1 C a n c e r R e s ， 2 0 1 5 ， 4 ( 3 ) ： 2 1 9 2 3 4 5 9 We i s e n b e r g e r D J，T r i n h B N，C a mp a n M，S h a r ma S，L o n g T I ，An a n t h n a r a y a n S，Ha n g G，E s t e v a F J ，Ho rto b a g y i G N， Mc C o rmi c k F， J o n e s P A， r d P WN u c l e i c A c i d s R e s ， 2 0 0 8 ， 3 6 ( 1 4 ) ： 4 6 8 9 4 6 9 8 6 0 L i M， C h e n W D， P a p a d o p o u l o s N， G o o d m a n S N， B j e r r e g a a r d N C ，L a u r b e r g S ， L e v i n B， J u h l H ， A r b e r N，M o i n o v a H ，Du r k e e K，S c h mi d t K，He Y P，Di e h l F，Ve l c u l e s c u V E，Z h o u S ， Di a z L A ，Ki n z l e r K W ， Ma r k o wi t z S D ， V o g e l s t e i n B N a t B i o t e c h n o 1 ， 2 0 0 9 ， 2 7 ( 9 ) ： 8 5 8 - 8 6 3 6 1 G u W，K o h W ，B l u m e n f e l d Y J ，E 1 一 S a y e d Y Y，H u d g i n s L，H i n t z S R，Q u a k e S RG e net Me d ， 2 0 1 4，1 6 ( 7 ) ： 5 6 4 5 6 7 6 2 B a r r e t t A N， Mc D o n n e l l T C， C h a n K C ，C h i t t y L S C l i n C h e m ， 2 0 1 2 ， 5 8 ( 6 ) ：1 0 2 6 - 1 0 3 2 6 3 Wh i t e R A 3 r d ， B l a i n e y P C，F a n H C， Q u a k e S R 肼 C C , e n o m i c s ， 2 0 0 9 ，1 0： 1 1 6 6 4 S h i r o g u c h i K， J i a T Z， S i m s P A， X i e X S P r o c N a t 1 A c a d s c ， 2 0 1 2 ，1 0 9 ( 4 ) ： 1 3 4 7 1 3 5 2 6 5 B o e t t g e r L M， Ha n d s a k e r R E， Z o d y M C， Mc C