冬虫夏草中腺苷含量的测定.doc

冬虫夏草及含片中腺苷含量的测定摘要目的：建立用HPLC法测定冬虫夏草及含片中腺苷的含量。方法：C18(4.6mm250mm,5um)色谱柱，0.05molL-1磷酸二氢钾+甲醇（90+10）为流动相，流速为1.0mlmin-1,检测波长260nm，柱温为35。结果：腺苷含量在0.0050.2ug(r=0.9998)范围内呈良好的线性关系。平均回收率为99.49%，RSD=1.47%。结论：方法准确可靠、结果稳定、重现性好，分析速度快，可有效控制制剂的质量。关键字：HPLC；冬虫夏草菌粉；含片；腺苷；DAD7AbstractObjective: to determine the contentof adenosineCordyceps powderandtablets byHPLC method.Methods: kromasil-C18( 4.6mm 250mm ,5um) column,using methanoltwo hydrogen0.5mol L-1phosphoric acid(90:10)as mobile phase,the flow rate was 1.0ml min-1,the detection wavelength was 260nm,the column temperature was 35.Results:adenosinein0.005 0.2ug(r=09998)showed a good linear relationshipin the range of.The average recovery was 101.16%,RSD=1.47%.Conclusion: themethod is Conclusion: the method is accurate and reliable, strong specificity, results stability, good reproducibility, which can effectively control the quality of the preparation.Keywords:Cordyceps sinensis powder;tablet;adenosine;HPLC目录摘要IAbstractII1. 前言21.1 仪器与试药22. 实验条件22.1 供试品提取溶剂的选择22.2 检测波长的选择22.3 流动相的选择23. 试验方法与结果33.1 分析溶液33.1.1 对照品溶液制备33.1.2 供试品溶液制备33.2 色谱条件33.3 分析方法学考察33.3.1 系统适应性试验33.3.2 标准曲线绘制及线型范围考察43.3.3 精密度试验43.3.4 重复性试验43.3.5 稳定性试验43.3.6 加样回收率试验43.3.7 样品测定44. 讨论54.154.254.35参考文献：6致谢71. 前言 冬虫夏草，仅仅是我国190多种虫草中的一种，也是中药传统的滋补药材。冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，主要活性成分是虫草素，是中国特有的虫生真菌，其有调节免疫力功能、抗肿瘤、抗疲劳等功效。在药理学现代研究结果中，青海冬虫夏草含有腺苷约7%，糖类28.9%，脂肪约8.4%，蛋白质约25%。其中冬虫夏草中82.2%为不饱和脂肪酸1。此外冬虫夏草中主要成分为腺苷，在2000版中国药典2和文献报道3中均采用高效液相色谱法测定虫草中腺苷的含量。在实际分析检测中其两种方法检测时，峰形对称性不佳，有一干扰峰且干扰严重，为了改善它对样品提取条件进行改进，取得了较好的效果，对冬虫夏草的质量控制提供了一定的技术依据。分析实验采用HPLC（高效液相色谱法）4，5分离技术，性能未定，能快速、准确测定其含量，样品的预先处理方法简单易行。1.1 仪器与药品的选择（1）Agilent1100高效液相色谱仪，配置在线脱气机、高压泵及梯度洗脱装置、自动进样器、C18(4.6mm250mm,5um)色谱柱、光电二极管阵列检测器（DAD）、Agilent色谱工作站、JD500E超声波清洗器，优普超纯水机。（2）腺苷标准品（上海永叶生物科技有限公司），水为UP水，甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。（3）冬虫夏草、冬虫夏草含片在青海省格尔木市冬虫夏草雪域专卖店购买。2. 分析测定前的准备2.1试验样品的预处理首先为了试验结果具有代表性，选择青海玉树品质优良的冬虫夏草。冬虫夏草和含片通过研钵研成粉末，这样有利于30%乙醇提纯。在样品预处理过程中应该防止引入其他杂质和腺苷含量的损失。2.2 试验提取样品溶剂的选择 由于腺苷的含量较低，干扰成分多，曾采用药典方法及文献报道2,3的方法，用90%甲醇和15%甲醇提取，均分离不好，拖尾严重，后经多次实验，采用30%乙醇超声提取后，蒸干，进行检测，峰形的对称性比较好，并消除了腺苷峰的拖尾现象及干扰峰，取得了较好的分离效果。2.3 HPLC检测器波长的选择取腺苷标准品溶液适量，调节波长在200400nm区间，在光电二极管阵列检测器中测出吸收光谱图，结果显示在260nm处有最大吸收，因此选择260nm为检测波长。2.4 流动相的选择利用药典方法中流动相：磷酸盐缓冲液（PH6.5）取0.01molL-1磷酸二氢钠68.5ml与0.01molL-1磷酸二氢钠31.5ml，搅拌均匀，调PH6.5甲醇（17：3）及0.05molL-1磷酸二氢钾甲醇为流动相，经过这两种流动相的试验，选择0.05molL-1磷酸二氢钾甲醇为流动相，以不同与比例进行反复试验，确定比例为(90:10)时峰形及出峰时间适宜。3. 测定方法及测定结果3.1 分析溶液3.1.1 制备对照品的标准溶液准确称取腺苷标准品0.0160g（经五氧化二磷为干燥剂减压24h），再加入30%的乙醇溶液溶解，加入50ml容量瓶中稀释至刻度线，摇匀，作为标准品储备液。3.1.2 样品溶液的制备准确称取冬虫夏草含片和菌粉各2.0000g，分别准确加入30%的乙醇溶液10ml，密塞，称定重量，超声30min，放至室温，再称定质量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤。按同样方法连续3次，将所得的滤液置于100ml容量瓶中并稀释至刻度，摇匀，作为试验溶液。3.2 HPLC色谱条件 色谱柱：C18,(4.6mm250 mm，5um)；流动相：0.05molL-1磷酸二氢钾+甲醇（90+10）；检测波长260nm；流速1.0mlmin-1；柱温：35。3.3 HPLC的试验过程及测定结果3.3.1 系统适应性的试验在上述色谱条件下，分别把试验溶液、标准品溶液放入自动进样器由计算机自动控制定量阀（进样量为10ul），按预先编制注射样品的操作程序工作。取样、进样、复位、样品管路清洗和样品盘的转动，全部按预定程序自动进行。试验色谱图中，在与标准品色谱图相应保留时间上，有一相同的色谱峰。（色谱图见图1）11 (A) (B)图1样品（A）与标准品（B）HPLC色谱图Fig 1.HPLC Chromatograms of reference sample (A) and substance (B) 1-腺苷（adenosine）3.3.2 绘制标准、线型曲线的范围控制 准确称取腺苷标准品，用甲醇稀释并制成每1ml含20ug的溶液。分别进样7次（0.25、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、10.0）ul，按上述色谱条件测定，并以进样量为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归。得回归方程：Y=8155.3X-6.5954，r=0,9998。腺苷在0.0050.2ug范围内有良好的线性关系。3.3.3 仪器精密度的试验准确吸取上述标准品溶液适宜，在上述色谱条件下，连续进样5次，记录腺苷面积，计算RSD（标准偏差）为1.35%。3.3.4 重复性试验 精密称取同一批号样品5份，以供试品溶液制备及上述色谱条件，平行测定6次，测定腺苷的含量分别为0.07431、0.07534、0.07485、0.08127、0.07853（mgml-1）,平均含量为0.07686mgml-1,RSD为0.27%（n=5）。3.3.5 稳定性试验 取精密度试验的标准品溶液，在室温下放置12、48h后测定，记录峰面积，两次测定的RSD为1.03%，1.31%。此方法稳定性较好。3.3.6 加样回收率试验称取已知含量的同一批样品3份，准确加入腺苷标准品适量，按样品测定，并用甲醇稀释一定含量，计算回收率。结果见表1.表1 加样回收率试验Table 1 sample recovery rate test批号 原含量（ug） 加入量（ug） 测定值（ug） 回收率（ug） 平均回收率（ug） RSD(%)1 6.4590 0.5090 7.0024 101.762 6.4380 0.7635 7.2524 107.47 99.49 9.33 6.4470 0.9753 7.5025 89.253.3.7 样品测定取不同批号的样品，按3.1.2项下的方法制成试验溶液。在选定的色谱条件下，对冬虫夏草菌粉及含片进行测定。计算腺苷的含量，测定结果见表2。表2 样品含量测定结果Table 2 results of sample determination编号（No ） 含量（content）mg RSD(%) 菌粉1 0.15734 0.98 含片2 0.07618 1.05 4. 讨论4.1 在与虫草药典和文献中相比，此实验在腺苷的提取方法上做了改进；由超声波提取法法跟同流提取法比较得出，选择超声波提取法工作30min效果最好。其次对乙醇提取的浓度做出比较分析，结论是：30%的乙醇比95%乙醇提取的完全（结果可见表2）。最后得出实验结论冬虫夏草菌粉中腺苷的含量高于含片中腺苷的含量。4.2 进行检测时用磷酸三钠溶液溶解样品，其流动相的浓度比例对虫草腺苷的分离峰形有一定的影响，由多次实验得出结论，0.05molL-1磷酸二氢钾-甲醇在流动相中的浓度比例应控制在（90:10）为佳。4.3 本方法简单、稳定，为冬虫夏草及制剂的质量控制提供了一种有效的分析方法。冬虫夏草菌粉及含片中腺苷含量的测定参考文献：1 Zhanglunli 张君莉（中国西藏网）2100.05.24-13:31:002CHP(中国药典)，2000，Vol I(一部)：86.3QI Yan-fei(戚雁飞)，HPLC Determination of compound adenosine hedgehog Capsules（HPLC测定复方猴头胶囊中腺苷的含量），Chinese medicine（中成药），2002,24（3）：1814Wu Chun-mei(吴春敏)，Ye Rong-ping(叶榕平)，HPLC Determination of Adenosine in Cordyceps（HPLC法测定冬虫夏草中腺苷的含量），Chinese herbal medicine（中草药），1999,30,（9）：658.5Li Xue-qing(李雪芹)，Wang-yan(王阎)，Bao Tian-tong(包天桐)，Determination of Adenosine in Cordyceps funny RP liqu