高效液相色谱-柱后同位素稀释质谱法定量分析人血清中转铁蛋白及白蛋白.pdf

第 4 2卷 2 0 1 4年 2月 分析化学 ( F E NX I HU A X UE ) 研究报告 C h i n e s e J o u r n a l o f An a l y t i c a l Ch e mi s t r y 第2期 1 7 91 8 5 DOI：1 0 3 7 2 4 SP J 1 0 9 6 2 0 1 4 3 0 9 06 高效液相 色谱- 柱后同位素稀释质谱法 定量分析人血清 中转铁 蛋 白及 白蛋 白 张 丹 冯流星 王 军 熊金平 ( 北京化工大学， 材料科学与工程学院， 北京 1 0 0 0 2 9 ) ( 中国计量科学研究院， 北京 1 0 0 0 1 3 ) 摘要建立了高效液相色谱( H P L C ) 与电感耦合等离子体质谱 ( I C P M S ) 联用， 同时结合柱后 同位素稀释 法 ， 通过直接测定硫及铁元素， 实现蛋白质绝对定量的分析方法。选取分子量不同的 4种标准蛋白： 转铁蛋 白、 8乳球蛋 白、 肌红蛋白和溶菌酶作为混合蛋白 3 4 S或” F e同位素稀释剂与液相色谱洗脱液经三通混合后， 在线进入 I C P MS检测。根据同位素稀释法公式及蛋 白中硫、 铁的含量计算混合蛋白中每种蛋白的浓度， 与 天平称量结果一致 ， 对方法进行 了验证 。将方法应用到人血清转铁蛋 白 、 白蛋 白的定量分析 ， 针对 两种 蛋 白含 量差别大导致的信号差异， 通过改变同位素稀释剂的流速， 成功测定了人血清中转铁蛋白、 白蛋白的含量。采 用” S及” F e同位素稀释剂分别定量的血清中转铁蛋白浓度为( 2 3 5 0 0 1 ) g L和( 2 2 2 0 1 3 ) g L ， 结果基 本吻合。方法精密度 R S D均小于 1 0 ， 可用于基体样品中含硫蛋白及金属蛋白的定量分析。 关键词同位素稀释；蛋白质定量；电感耦合等离子体质谱； 转铁蛋白；白蛋白 1 引 言 蛋 白质组学的快速发展 ， 不但需要准确鉴定蛋 白质 ， 还要求对处于动态变化 的蛋 白质进行定量分 析 J 。目前比较成熟的定量方法多是基于稳定 同位素标记的生物质谱 ， o J ， 但是生物质谱的信号响 应与蛋 白质或肽段含量间的关系十分复杂 ， 没有蛋 白质标准作归一化处理 ， 很难对蛋 白质或肽段定量。 与生物质谱不同， 电感耦合等离子体质谱( I C P M S ) 分析中元素的响应与原子所处的分子环境无关 ， 而且样品处理简单 ， 易于色谱联用 ， 可进行 同位素分 析 j 。因此 ， 利用 I C P MS对蛋 白质中的元素定量 分析， 是近年来蛋白质定量技术研究的热点。硫是最适合作为蛋白质定量分析的元素 j 。根据 S w i s s P r o t 蛋 白质数据库的统计分析 ， 分别有 9 6 6 、 9 8 8 的蛋 白质含有半胱氨酸 、 甲硫氨酸等含硫氨基 酸 _ l 。 J 。如果蛋 白质的氨基酸序列已知 ， 就能确定其中的硫原子数 ； 那么通过 I C P MS测定硫的含量来实 现蛋白质 的定量是完全可行的 。但是 ， 目前 I C P 。 M S直接测定硫来定量的蛋白， 主要是标准蛋 白， 涉及 基体样品的很少 ， 因为 I C P MS测量硫存在一些困难 ： 需使用碰撞池技术或高分辨 I C P MS克服 O ； 对硫 的 谱线干扰 。常见的 I C P MS对蛋 白质定量研究集中在金属蛋 白上 J ， 定量原理与含硫蛋 白相同。 为保证定量分析的准确度 ， 需使用与待测蛋 白匹配的标准物质来保障质控与量传 ， 但 由于蛋 白质种 类繁多 、 结构复杂 ， 目前可获得的蛋 白标准十分匮乏 。同位素稀释法( I D) 是 国际公认的具 有权威性化 学计量方法 ， 只需硫或金属的浓缩同位素即可实现不同基体蛋白的定量分析_ l 。 高效液相色谱 ( HP L C ) 的同位素稀释法分为特异性 、 非特异性形态 _ 1 。前者在前处理时就将稀释 剂加入到样品中， 具有传统同位素稀释法的优点 ； 但是必须开发针对 目标蛋 白的特异性稀释剂制备方 法， 目 前商品化或人工合成的稀释剂非常有限， 直到2 0 0 5年才有文献报道第一次应用到蛋白质的定量 分析 。而非特异性形态 同位素稀释( 也称柱后同位素稀释) 对蛋 白质的种类 、 结构没有要求 ， 同位素 稀释剂常为某元素的简单离子 ， 基本都有商品化的产 品， 适合于蛋 白质的定量分析。 目 前， 文献报道了高效液相色谱 柱后同位素稀释质谱法( H P L C I D I C P M S ) ， 通过测硫定量标准蛋 白 和测铁定量转铁蛋白 14 ， 但是未见对硫、 铁共同定量蛋白的比较及人血清中多种蛋白的定量。本 研究采用液相色谱分离混合蛋 白， I C P MS测硫 、 铁分别定量的标准蛋白结果与天平称量结果 比较， 验证 2 0 1 3 9 1 8收稿 ； 2 0 1 3 1 0 - 2 4接受 本文 系国家质检总局公益性行业科研专项( N o 2 0 1 1 1 0 0 0 8 ) 资助项 目 E m a il ： f e n g l x n i m a c c n ； x i o n p m a i l b u c t e d u e n 1 8 0 分 析 化 学 第4 2卷 了 H P L C I D I C P M S方法 ， 并对硫 、 铁定量分析进行 比较。在此基础上 ， 将方法应用到人 血清 中转铁蛋 白、 白蛋 白的定量分析 ， 测定了血清 中两种蛋 白的含量。本方法体系可应用在食品安全、 环境监测、 临床 检验的化学计量、 相关实验室认证等生命科学研究的重要领域 ， 促进我 国生命科学测量水平的不断提高 和测量溯源性研究的深入发展 。 2 实验部分 2 1 仪器、 试剂与样品 E l e m e n t 2 扇形磁场电感耦合等离子体质谱仪( 美国T h e r m o F i s h e r S c i e n ti fi c 公司) ； 高效液相色谱系 统 ( 日本 S h i m a d z u公司) ： 含 L C 3 0 A D泵 、 L C - 2 0 A D泵 、 S I L 一 3 0 A C 自动进样器 、 C T O 2 0 A柱 温箱 、 S P D 一 2 0 A紫外检测器 ； T o l e d o型电子天平 ( 瑞士 Me t t l e r 公司) ； Mi l 1 Q超纯水系统 ( 美 国 Mi l l i p o r e公司) ； T S K G e l G 3 0 0 0 S Wx l 凝 胶柱 ( 3 0 0 m m 7 8 m m， 日本 T o s o h公 司) ； S h o d e x Q A 8 2 5 I E C色 谱柱 ( 7 5 m mx 8 0 m m，日本 S h o d e x公司) T r i s 、 人血清转铁 蛋 白 T r a n s f e r r i n( T f ， 7 5 2 k D a ， 每分子 含 4 7个 s原 子) 、 白蛋 白 A l b u m i n( A l b ， 6 6 4 k D a ， 含 4 1 个 S原子) 、 牛 B乳球 蛋 白 L a c t o g l o b u l i n ( L a c b ， 1 8 3 6 k D a ， 含 9个 S原子 ) 、 鸡溶菌酶 L y s o z y me ( L y s ， 1 4 3 1 k D a ， 含 1 2个 S 原子 ) ， 均购 自S i g ma 公司 ； 甲酸铵 、 乙酸铵 ， 购于 F i s h e r S c i e n t i fi c 公 司； 马心肌红蛋 白 M y o g l o b i n ( My o ， 1 6 9 5 k D a ， 含 3个 s原子) 、 人血清样品来 自中国计量科学研究院； 其 它试剂均为 国产分析纯 ； 实验用水为超纯水 ( 1 8 2 Mr ) c m) 。 4种标准蛋白 T f ，L a c b ，M y o和 L y s 用天平准确称量后混合 ， 溶于超纯水中备用 ； 人血清样品不经 任何处理 ， 直接进入液相色谱进行分析 。 s浓缩同位素 ( 美国橡树岭实验室) ： 同位素 s s丰度 比为 0 0 1 4 1 7； F e 浓缩同位素( 中国计量 科学研究院) ： 同位素 F e F e 丰度比为 0 1 1 3 1 3 。 2 2 电感耦合等离子体质谱仪条件 仪器工作参数为： 功率 1 3 0 0 W， 样 品气 流速 1 0 5 L m i n ， 辅 助气 流速 0 8 7 L mi n ， 冷 却气流 速 1 6 0 L m i n ， 分辨率( m A m)4 0 0 0 ； 扫描次数 7 0 0 x 1 。 2 3 高效液相色谱分离条件 2 3 1 尺寸排阻色谱( S E C) 分离混合标准蛋白 尺寸排阻液相色谱常用的流动相中高浓度盐( 如 N a C 1 等 ) 在质谱锥上的堆积会影响 I C P MS测量； 文献 1 8 研究发现 ， 0 2 m o l L乙酸铵作 为流动相时 既能保证分离效果 ， 又不会引人高浓度盐 ； 而且质谱连续工作 8 h ， 没有发现明显的碳堆积。本实验所用 的流动相为 0 1 m o l L乙酸铵溶液 ， 流速为0 4 mL m i n ，紫外检测器波长 2 8 0 n m， 分析时间 4 0 m i n ， 等 度洗脱。 2 3 2 阴离子交换色谱 ( I E C) 分离人血清由于转铁蛋 白与 白蛋 白分子量接近 ， 尺寸排阻色谱柱分离 人血清时， 两者的保 留时间重合 ， 不能达到分离效果 ， 因此采用阴离子交换柱 S h o d e x Q A 一 8 2 5 I E C分离人 血清。液相分离条件为 A相 ： 0 0 2 m o l L T r i s HC 1 ( p H 8 6 ) ； B相 ： A+ 0 5 mo l L甲酸铵溶液 ， 流速为 0 7 m L m in ， 时间程序： 0 3 0 m i n ， 0 1 0 0 B ； 梯度洗脱。 紫外检测器波长为2 8 0 n m 。 2 4 HP L C- I D I C P - MS分析 柱后 同位素稀释时， 稀释剂通过岛津液相系统 自带 的 L C 2 0 A D泵加入 ， 与液相色谱 的洗脱液经过 三通混合后在线进入 I C P M S 检测。液相色谱实现混合蛋白分离， I C P M S 检测对蛋白定量分析。 质谱得到的同位素比值谱图， 根据同位素稀释公式( 1 ) ， 转化为元素的质量流( M a s s fl o w ) 谱图。积 分质量流谱图中的峰面积可得到相应蛋白中该元素的绝对含量， 依据液相进样体积及蛋白所含元素个 数 ， 就可计算 出蛋白的绝对浓度 。 ， M ( R 一R ) s s 屯 式中， C s p ， d s p 和 分别代表同位素稀释剂的浓度( n g ) 、 密度( g mL ) 和流速( m L mi n ) ； M 和 M 分别 表示样品和稀释剂中元素的原子量 ； A 和 分别表示样品和稀释剂 中核素 b的丰度 ； R ， R 和 R 分 第 2期 张 丹等 ： 高效液相色谱一 柱后同位素稀释质谱法定量分析人血清中转铁蛋白及白蛋 白 1 8 1 别表示混合样品 、 稀释剂和样 品中核素 a 与核素 b的丰度 比。 血清中目标蛋 白的正常含量范围不同： 转铁蛋 白 2 3 53 0 O g L ， 白蛋白 3 5 5 0 g L ； 导致两种蛋 白中硫含量差别很大， 为保证 R 比值合适， 采用改变稀释剂流速的方法， 在液相时间程序的前 1 5 m in ( 转铁蛋白出峰部分) ， 。 s同位素稀释剂的流速为 7 O 0 T T ra l1 r rin L ，S 。 La c b： L a c t o gl o bu l i n M y O： Myo g l o bm 。 Lys ： Lys o z y m e _ jL 。 8 0 詈6 0 40 詈 2 0 O 0 一S JIII 八f f 0 l O 2 O 3 0 4 0 Time mi n 鲁 丢 S 言 罴 路 葛 翟 0 旦 0 兰 图2 混合标准蛋白的质谱图， a ： S E C I D I C P MS 谱图； b ： 硫元素的质量流及同位素比谱图 F i g 2 Ma s s s p e c t r u m o f mi x e d s t a n d a r d p r o t e i n s ， a：S EC I D I C P MS；b：c h r o ma t o g r a m o f ma s s flo w o f s u l f u r a n d i s o t o p e r a t m 表 1 S E C I D I C P MS绝对定量蛋白质结果 Ta b l e 1 Ab s o l u t e q u a nt i t a t i v e a n a l y s i s o f p r o t e i n s a 分析结果表不为平均值4 - 标准偏 差( n =3 ) ； b 假定蛋 白质纯度为 1 0 0 。 a D a t a a r e m e a nS D( n =3 ) ： b T h e p u r i t i e s o f s t a n d a r d p r o t e i n s a r e 1 0 0 从表 1可见 ， S E C I D I C P MS方法 的分析 结果 与天 平称量 结果 一 致 ， 蛋 白质浓 度 的 R S D g 皇 0 0 t rai n 图4 人血清的液相分离谱图 F i g 4 L i q u i d c h r o ma t o g r a m o f h u ma n s e rum 4， 在 3 0 mi n内， 血清中免疫球蛋 白( I g G ) 、 转铁蛋白( T f ) 、 白蛋白( A l b ) 实现了成功分离， 相应 的保 留时间 分别为 8 3 ， 1 3 0和 2 1 8 rai n 。但是液相谱 图的基线不太稳 ， 这与梯度洗脱 中流动相始终在变化有关。 I C P M S在线检测到 S S 比值如图 5 a 所示 ， 由于正常人血清中转铁蛋 白、 白蛋 白的含量差异导 致两种蛋白的硫含量相差悬殊 ， 因此 T f 峰中 S信号值最大为 1 1 1 0 c p s ( c o u n t s p e r s e c o n d ) ， 而 A l b 中最大信号强度约2 0 x 1 0 。 c p s ； 若稀释剂信号稳定， 则两种蛋白的同位素比值 R ( s M S ) 很难达到 合适值 ， 影响蛋 白定量的准确性。改变稀释剂流速 ， 可以很好地解决这个问题。前 1 5 ra i n ， MS稀释剂流 速为 0 0 3 m L mi n ， R 近似 1 ； 之后提高流速到 0 2 m L mi n ， R 一2 2 。图5 a表明， 即使改变流速 ， 稀释 剂信号也能迅速达到稳定。s 元素的质量流谱图如图5 b 所示， 定量分析结果与正常含量的比较见表3 。 第 2期 张 丹等 ： 高效液相色谱一 柱后同位素稀释质谱法定量分析人血清中转铁蛋白及白蛋白 1 8 3 邑 一 弓 ； 皇 皇 5 0 0 0 4 00 0 3 00 0 。0 2 00 0 0 l o 0 0 0 Al b l g G Tf = 0 0 0 兰 图5 ( a ) 人血清的 H P L C I D I C P MS质谱图， ( b ) 硫元素的质量流及同位素比谱图 F i g 5( a )H P L C I D I C P M S s p e c t r u m o f h u m a n s e r u m，( b )e h r o m a t o g r a m o f m a s s fl o w o f s u l f u r and i s o t o p e r a t i o 表 3 H P L C I D I C P M S绝对定量人血清中 T f 和 A l b ( n =3 ) T a b l e 3 Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t r a n s f e r r i n a n d a l b u m i n i n h u m a n s e rum( n = 3 ) 由表 3可知 ， H P L C I D I C P MS定量人血清中转铁蛋 白、 白蛋 白的浓度均在正常含量范围 内， 且实验 结果 R S D 2 ( n = 3 ) 。本方法用于定量血清中蛋 白含量及其它基体样品是完全可行的， 进一步研究了 铁定量血清中转铁蛋 白。 用 F e 作为同位素稀释剂 ， 质谱在线测得 F e F e 的 比值及质量流谱 图如图 6所示。转铁蛋 白 分离过程 中， F e稀释剂信号的稳定性不如 s稀释剂 ， 可能是梯度洗脱时 ， 流动相改变对转铁蛋白上铁 的结合产生影响， 或者流动相改变引起的稀释剂信号浮动。 鲁 S 言 器 上 _上 0 1苦 0 0 图 6 人血清 中转铁蛋 白的质谱 图， a ： H P L C I D I C P MS谱 图； b ： 质量 流及同位素比谱 图 F i g 6 Ma s s s p e c t rum o f t r a n s f e r r i n i n h u ma n s e ru m，a ：HP L C I D I CP MS；b：c h r o ma t o g r a m o f ma s s flo w o f i r o n a n d i s o t o p e r a t i o 对转铁蛋 白进行峰面积积分 ， 计算的蛋白浓度为( 2 2 2 + 0 1 3 ) L ； 与硫定量结果( 2 3 5 _+ 0 O 1 )g L相 比， 铁定量 T f 时 ， 蛋 白浓度的 R S D偏大。这与蛋白质内 s和 F e的存在形式不 同有关 ， s在蛋 白质 中基 本是以半胱氨酸或 甲硫氨酸里的硫共价键存在 ， 稳定性高 、 丰度大 ； 而 F e与蛋 白质 以非共 价键结合 ， 作 用力较弱 ， 更容易受到外界条件 ( 如流动相 p H值 、 离子强度 、 极性溶液等) 影响。 4 结 论 柱后同位素稀释法与 H P L C I C P M S 在线分析联用， 弥补了蛋白样品前处理复杂、 标准蛋白缺乏、 蛋 白定量偏差大的不足。本研究建立的高效液相色谱 柱后同位素稀释质谱方法， 通过 s和 F e 定量的混 合标准蛋 白结果与天平称量结果一致 ， R S D 1 0 。在此基础上 ， 进一步将方法应用到人 血清 中转铁 蛋 白、 白蛋白的绝对定量分析， s 和 F e 分别定量的血清中转铁蛋白浓度基本吻合， 为今后血清中微量蛋白 6 5 4 3 2 1 O l 8 4 分 析 化 学 第 4 2卷 及其它基体样品中含硫蛋 白、 金属蛋白的定量提供 了新 的思路和手段。 Re f e r e nc e s 1 Ae b e r s o l d R，Ma nn MNa t u r e，2 00 3，4 2 2：1 9 820 7 2 S U I S h a o H u i ，D O N G J u n J u n ，WA N G J i n g L a n ，C A I Y u n ，Q I A N X i a o Ho n g C h i n e s e A n a 1 C h e m ， 2 0 1 2， 4 0 ( 2 ) ： l 7 71 8 3 隋少卉，董俊军， 工京 ，蔡 耘， 钱小红分析化学， 2 0 1 2， 4 0 ( 2 ) ： 1 7 7 1 8 3 3 S a n z Me d e l A，Mo n t e s Ba y 6 n M，B e t t me r J ，F e r n fi n d e z S a n c h e z M L T r A C T r e n d s A n a 1 C h e m， 2 0 1 2， 4 0： 5 2 6 3 4 B A I Ha i Xi n，L I U Xi a o Hu a ，YANG F a n，YANG Xi u Ro n g，WANG E r Ka n g C h e m_， C h i n e s e U n i v e r s i t i e s ， 2 0 1 0， 3 1 ( 7) ：1 31 4 1 3 2 1 海鑫， lJ l s 花， 杨 帆 ， 杨秀荣， 汪尔康高等学校化学学报， 2 0 1 0 ， 3 1 ( 7 ) ： 1 3 1 4 1 3 2 1 5 M I We i ， WA N G J i n g P r o g r e s s i n B i o c h e mi s t r y a n d B i o p h y s i c s ， 2 0 1 0 ， 3 7 ( 2 ) ： 2 2 4 - 2 2 9 米 薇 ，乇 晶生物化 学与生物物理进展 ， 2 0 1 0 ， 3 7 ( 2 ) ： 2 2 4 2 2 9 6 Z HU J i n L e i ， Z H A N G K a i ， H E X i We n ， Z H A N G Y u K u i C h i n e s e， A n a 1 C h e m ， 2 0 1 0 ， 3 8 ( 3 ) ： 4 3 4 4 4 1 朱金蕾 ， 张 锴， 何锡文， 张玉奎分析化学， 2 0 1 0 ， 3 8 ( 3 ) ： 4 3 4 4 4 1 7 B e t t m e r J ， J a k u b o w s k i N， P r a n g e A A n a 1 B i o a n a 1 C h e m ， 2 0 0 6 ， 3 8 6 ( 1 ) ： 7 - 1 1 8 W ANG Me ng，FENG W e i Yue， L U We n We i ， L I Ba i ，W ANG Bi ng，ZHU Mo Ta o，W ANG Yu n，ZHAO Yu Li a n g， C HA I Z h i F a n g C h i n e s e _， A n a 1 C h e m ， 2 0 0 8 ， 3 6 ( 3 ) ： 3 2 1 - 3 2 4 1 i萌， 丰伟悦，陆文伟 ， 李 柏，汪 冰， 朱墨桃， 王 云 ， 赵宇亮， 柴之芳分析化学， 2 0 0 8 ， 3 6 ( 3 ) ： 3 2 1 3 2 4 9 Wi n d M ，W e g e n e r A，E i s e n me n g e r A ，Ke l l n e r R，L e h ma n n W D A n g e w a n d t e C h e mi e I n t e r n a t i o n a l E d i t i o n，2 0 0 3， 4 2( 2 9)：3 4 2 5 3 4 2 7 1 0 R a p p e l C， S e h a u m l o f f e l D A nal y t i c a l a n d B i o a n a l y t i c a l C h e m i s t r y ， 2 0 0 8 ， 3 9 0 ( 2 ) ： 6 0 5 6 1 5 1 1 Wa n g M ，F e n g W Y，L u W W ，L i B，W a n g B， Z h u M T，W a n g Y，Yu a n H ，Z h a o Y L，C h a i Z F An a 1 C h e m， 2 0 0 7， 7 9( 2 3 )：9 1 2 8 9 1 3 4 1 2 B a n d u r a D R， B a r a n o v V I ， T a n n e r S D A n a l C h e m， 2 0 0 2 ， 7 4 ( 7 ) ： 1 4 9 7 1 5 0 2 1 3 F r a n k C， R i e n i t z O， S w a n C， S c h i e l D A n a l y t i c a l a n d B i o a n a l yti c a l C h e m i s t ry， 2 0 1 3 ， 4 0 5 ( 6 ) ： 1 9 1 3 1 9 1 9 1 4 G r e b e M，P r f r o e k D，Ka k u s c h k e A，C a s t i l l o B u s t o M E，Mo n t e s B a y 6 n M ，S a n z Me d e l A，B r o e k a e J A C，P r a n g e A J A n a 1 A t S p e c t r o m，2 0 1 2，2 7：4 4 0 44 8 1 5 H U N G Z h i D i n g ，WA N G J u n ，L U H a i ，Y A N G X i a o J i n J o u r n a l o f C h i n e s e Ma s s S p e c t r o m e t r y S o c i e t y ，2 0 1 3 ， 3 4( 1 ) ： 5 76 4 黄志丁 ， 王 军 ，逯 海 ， 杨 晓进质谱 学报 ， 2 0 1 3， 3 4 ( 1 ) ： 5 7 6 4 1 6 C a s t i l l o B u s t ( ) M E， Mo n t e s B a y 6 n M， S a n z Me d e l A A n a 1 C h e m ， 2 0 0 6， 7 8 ( 2 4 ) ： 8 2 1 8 - 8 2 2 6 1 7 H a =T i n g t o n C F ， V i d l e r D S ， Wa t t s M J ， H a l l J F A na1 C h e m ， 2 0 0 5 ， 7 7 ( 1 3 ) ： 4 0 3 4 4 0 4 1 l 8 L i u R， L v Y，H o u X D，Y a n g L ， Me s t e r Z A n a 1 C h e m ， 2 0 1 2 ， 8 4 ( 6 ) ： 2 7 6 9 2 7 7 5 Ab s o l u t e Qu a n t i fi c a t i o n o f T r a n s f e r r i n a n d Al b u mi n i n Hu ma n Se r u m b y S pe c i e s un s pe c i fic I s o t o p e Di l u t i o n- - Li q ui d Ch r o ma t o g r a p h y - I n d u c t i v e l y Co u p l e d Pl a s ma M a s s S p e c t r o me t r y ZHA NG Da n 一，F ENG L i u Xi n g“，WANG J u n ，XI ONG J i n P i n g ( B e ij i n g U n i v e r s i t y o f C h e m i c a l T e c h n o l o g y ， C o l l e g e o f Ma t e r i a l S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y ， B e ij i n g 1 0 0 0 2 9 ，C h i n a ) ( N a t i o n a l I n s t i t u t e o fMe t r o l o g y ， B e ij i n g 1 0 0 0 1 3 ， C h i n a ) Abs t r ac t A me t h o d b a s e d o n s p e c i e s - - u n s p e c i fic i s o t o p e d i l ut i o n - h i g h p e r f o r ma n c e l i q u i d c h r o ma t o g r a p h y c o u p l e d w i t h i n d u c t i v e l y c o u p l e d p l a s ma m a s s s p e c t r o me t r y ( H P L C I D I C P MS )w a s e s t a b l i s h e d f o r t h e a bs o l u t e q ua n t i fi c a t i o n o f p r o t e i n s b y me a s u r i n g s u l f u r a n d i r o n F o u r s t a n d a r d p r o t e i ns i n c l u d i n g t r a n s f e r r i n， 第 2期 张 丹等 ： 高效液相色谱一 柱后同位素稀释质谱法定量分析人血清中转铁蛋白及 A蛋 白 1 8 5 l a c t o g l o b u l i nmy o g l o b i n a n d l y s o z y me we r e s e p a r a t e d a n d o n l i n e d e t e r mi n e d v i a s u l f u r o r i r o n b y e n r i c h e d S o r F e i s o t o p i c s o l ut i o n s c o n t i nu o u s l y mi x i n g wi t h t h e e l u a t e f r o m l i q u i d c h r o ma t o g r a p h y Ab s o l u t e q u a nt i fic a t i o n o f p r o t e i n s wa s c a l c u l a t e d b y t h e i s o t o pe di l u t i o n e q u a t i o n a n d s u l f u r o r i r o n c o n t e n t i n p r o t e i ns Th e me t h o d o l o g y wa s v a l i d a t e d b y c o mp a r i ng wi t h g r a v i me t r i c a n a l y s i s r e s u l t s Fu r t h e r mo r e，t h i s me t h o d wa s s u c c e s s f u l l y a pp l i e d t o t h e q u a n t i fic a t i o n o f t r a ns f e r r i n a n d a l b u mi n i n h u ma n s e r u m b y me a n s o f c h a n g i ng t h e fl o w r a t e o f i s o t o p i c s o l u t i o n T h e me a s u r e d r e s u l t s o f t r a n s f e r r i n v i a s u l f u r a n d i r o n w e r e( 2 3 5 0 O 1 ) L ， ( 2 2 2 0 1 3 )g L ， r e s p e c t i v e l y ，w h i c h w a s i n g o o d a g r e e me n t a n d t h e R S D s w e r e a l l w i t h i n 1 0 T h e me t h o d c a n b e us e d t o q ua n t i f y s u l f u r c o n t a i ni ng p r o t e i n s a nd me t a l l o p r o t e i n s i n b i o l o g i c a l s a mpl e s Ke y wor ds I s o t o pe d i l u t i o n； Pr o t e i n q u a n t i fic a t i o n； I n d u c t i v e l y c o up l e d p l a s ma ma s s s p e c t r o me t r y； Tr a