高分辨飞行时间质谱在蛋白质组学相对定量分析中的应用.pdf

第 4 4卷 2 0 1 6年 3月 分析化学 ( F E N X I H U A X U E) 研究报告 C h i n e s e J o u r n a l o f An a l y t i c a l C h e mi s t r y 第 3期 40 340 8 DOI ： 1 0 1 1 8 9 5 j i s s n 0 2 5 3 - 3 8 2 0 1 5 0 7 5 1 高分辨飞行 时间质谱在 蛋 白质 组 学 相 对定 量 分 析 中的应 用 洪 晓愉 王 浩 徐金玲 李水 明 王 勇 ( 深圳大学生命科学学院， 微生物工程重点实验室， 深圳 5 1 8 0 6 0 ) ( 深圳大学生命与海洋科学学院， 深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室， 深圳 5 1 8 0 6 0 ) 摘要利用 T r i p l e T O F 5 6 0 0高分辨质谱仪分析牛血清白蛋白等 3种蛋白质标准品， 研究了质谱离子强度与 蛋白质样品相对含量的相关性。蛋 白质标准品用胰酶酶切后 ， 稀释成l 一1 0 2 4 f m o l 7 I L L的系列溶液， 考察 在11 0 2 4 f m o l 上样量情况下， 肽段的前体离子计数( c p s ) 、 蛋白质全部肽段的离子计数之和以及被检出肽段 数 目与上样量的相关性， 以及相同样品在 3次平行实验之间这些数值的变化幅度。结果表明。被检出肽段数 目与上样量正相关 ， 当c p s 超过 1 0 0 0时， 所有肽段离子强度之和与上样量呈线性关系， 但是用最灵敏肽段的 离子强度表示更为准确。3次测量同一肽段的最高离子强度通常不会超过最低强度的 1 5倍 ， 提示当不同样 品中同一蛋白的离子强度相差 3倍以上是判断不同样品中相同蛋白质的含量具有差异的可靠阈值。本研究 提供了一种利用高分辨率和高扫描速度蛋白质组组学定性数据进行半定量分析的方法 ， 简便、 快速， 可为相关 生物学和医学研究提供参考。 关键词定量蛋白质组学；高分辨飞行时间质谱；打击计数； 信号强度 ； 无标记定量 1 引 言 了解特定生物学过程 ， 不仅要知道所涉及的分子种类 ， 还需要 明晰它们 的含量及动态变化 。具有高 通量 、 高灵敏度 、 高线性范围和较高准确度 的定量蛋白质组学近年来发展迅速， 在生物学和医学研究中 的应用 日 益广泛 “ 。按照不同的定量原理， 定量蛋白质组学技术可分为依据凝胶成像和液相色谱一 质 谱信号强度两种定量技术。前者主要利用双 向电泳 ( 银染或考染 ) 或双 向荧光差异凝胶 电泳 ( D I G E) I s ， 在蛋白质水平上进行定量分析 ， 蛋 白质 的定量和序列鉴定是两个独立的步骤 ， 其优点是差异 蛋 白被真正分离 ， 并且更为直观 ， 但是操作繁琐耗时 ， 各种翻译后修饰的存在使得“ 单一” 蛋 白点上有可 能是分子量和等电点非常接近的蛋 白质 的混合物。随着多维液相色谱 质谱技术 和数据处理软件的不 断发展 ， 基于质谱的定量蛋 白质组学技术逐渐成为该领域的主流技术 。 基于质谱的定量分析是将蛋 白质通过特异性酶切水解成适于质谱检测的肽段 ， 在进行肽段序列鉴 定的同时提取质谱信号 的强度信息 ， 然后将来 自肽段 的定量信息还原成蛋 白质 的定量信息。根据定量 分析 目的， 又分为以三重四级杆质谱为平 台的绝对定量分析( S R M) 和在其它串联质谱上实现的相对 定量分析 。绝对定量分析是对 已知蛋 白和肽段的靶 向测定 ， 灵敏度高 ， 抗干扰性强 ， 但通量较小并需 要合成 目标肽段。 目前应用更为广的方法是在高分辨质谱上同时实现蛋 白质的鉴定和定量分析 ， 按照 定量分析策略， 后者又可分为稳定 同位素标记定量分析 和无标记定量分析 两类 J 。典型的标 记定量分析方法有两种 ： 需要含 同位 素标记 的细胞 培养基 ( S I L A C) 和需要增加蛋 白质处理步骤的 i T R A Q 方法 ， 虽然成本较高， 但 由于其稳定性和准确性较高 ， 目前被许多研究者在发现蛋 白质组学 中 所采用。非标定量分析方法包括信号强度法和谱 图计数法 ， 其在实验操作上与定性分析相似 ， 但要求复 杂 的数据提取和处理方法 ， 并且 每个样 品需至 少平行 测定 3次 ， 以消除各种 偶然误差 ， 耗 时较 长。 S I L A C和 i T R A Q分别根据一级和二级质谱信号进行定量分析。近年来 ， 根据三级 串联质谱信号定量分 析和各种非数据依赖型采集方法的发展很快 。 2 0 1 5 - 0 9 2 2收稿 ； 2 0 1 5 1 2 1 2接受 本 文系深圳市科技项 目( N o s J S G G 2 0 1 4 0 7 0 3 1 6 3 8 3 8 7 9 3 ， 2 0 1 5 0 0 0 6 ) 资助 E ma i l ： wy o n g S Z U e d u c n 分 析 化 学 第 4 4卷 但是 ， 在一些生物学项 目中， 研究者也希望根据单次的蛋 白质组学定性实验结果 ， 得到某些 目标蛋 白含量的粗略比较 ， 为下一步实验提供研究方向和决定是否进行定量分析蛋白质组学分析。因此 ， 如果 在蛋白质组的定性鉴定实验中提取出半定量分析信息 ， 将有助于满足这样 的实验需求 。在 P r o t e i n p i l o t 搜库软件输出的肽段汇总列表中， 除肽段序列、 误差和保留时间等指标外， 还包括前体离子强度的信息， 即总打击计数( c o u n t s ) ， 它是通过对色谱峰上所有采样点的数据求和所得。为便于不 同实验条件 的比 较 ， 该值 以每秒打击计数 ( e p s ) 的形式表示 ， 如果该离子被多次扫描 ， 在删除重复项之后 ， 系统会 留下最 高值。无标记定量分析中通常采用色谱峰的峰面积定量分析 ， 但需要对每个肽段逐一进行提取 ， 而利用 c p s 的优势在于该值可 自动输出， 方便快捷 。用该值近似表示肽段含量涉及 以下问题 ：( 1 ) 由于是定性 鉴定实验 ， 一级谱扫描时问较短 ， 取点较少 ， 保 留时问的微小变化可能对结果产生较大影响 ， 因此需进行 平行实验 ； ( 2 ) 需证明前体离子信号强度与蛋 白质含量是否线性 相关 ； ( 3 ) 需考察单一肽段的离子强度 和所有肽段离子强度之和哪一种更为准确及适用条件 ； ( 4 ) 被检测肽段数 目如何随蛋 白质浓度变化。 基于以上问题 ， 本研究将 3种标准蛋 白质按照浓度呈 2 4倍 的增加梯度配成 1 0 。 1 0 mo l L的蛋 白 质标准溶液 ， 每个样品浓度重复测定 3次， 考察 3次平行实验中肽段强度的变化 幅度及被检测肽段数 量 、 单一肽段强度及所有肽段强度之和与蛋白质浓度的关系， 分析上述指标的影响因素 ， 为利用不 同样 品单次测定的质谱强度 ( e p s 值) 半定量分析 比较蛋白质相对含量的可能性和应用条件提供实验依据。 2 实验部分 2 1仪器与试剂 E k s i g e n t n a n o L C U l t r a 2 D二维纳升液相色谱系统 、 T r i p l e T O F 6 0 0高分辨质谱仪 、 P r o t e i n P i l o t 4 5 软件( A B S C I E X， 美国) ； 真空冷冻干燥机( T h e r m o S a v a n t ， 美国) 。 牛血清 白蛋 白( B S A) 、 卯清蛋 白( O V A) 、 溶菌酶 C ( L Y Z C ) 和胰蛋 白酶( S i g ma 公司) ； 其它试剂至少 为分析纯 ； 实验用水为超纯水( 1 8 2 MD a m) 。 2 2样 品处理 称取 1 0 0 mg 各种蛋 白粉末 ， 分别加入 2 5 m m o l L N H C O 配制成 1 m g mL蛋 白溶液 ， 按照蛋 白与 酶质量 比为 4 0 ： 1 的比例加入胰酶 ， 在 3 7 C 水浴酶切 1 6 h ， 最后将得到 的酶切液逐级稀释 ， 配制成 1 1 0 2 4 f m o l 7 L的样品。 2 3 反相色谱 -T r i p l e T O F分析 将 3种蛋 白质 的酶切液首先上样到 C 预柱 ( 1 0 0 I, mx 3 e m， 3 m， 1 5 m) 上， 上样 量 7 ， 流速 2 ix L m i n ，冲洗脱盐 1 0 mi n 。分析柱为 C l 8 反相色谱柱 ( 7 5 m 1 5 a m， 3 I, z m，1 2 0 A， C h r o m X P E k s i g e n t ) ， 流动相 A为水一 乙腈 ( 含0 1 甲酸) ( 9 8 ： 2 ， ) ， 流动相 B为乙腈 水( 含0 1 甲酸) ( 9 8 ： 2 ， ) 。 梯度洗脱 ： 0 2 mi n ， 5 B； 21 8 mi n ， 5 4 0 B； 1 8 2 4 mi n ， 8 0 B； 2 4 3 0 m i n ， 5 B 。质谱分析 采用 T r i p l e T O F 5 6 0 0结合纳升喷雾 I I I 离子源 ， 喷雾电压为 2 4 k V， 气帘气压力为 3 0 P s i ， 雾化气压力为 5 P s i ， 加热温度为 1 5 0 C， 扫描方式为信息依赖的采集工作模式( I n f o r m a t i o n d e p e n d e n t a n a l y s i s ， I D A) 。 2 4数据分 析 质谱采集到 的原始 w i ff图谱文件 ， 采用 P r o t e i n P i l o t S o f t w a r e v 4 5( A B S C I E X，美国) 软件对 3种 蛋白质进行检索分析 ， 检索参数设置为胰蛋 白酶酶切和生物学修饰 ， 假 阳性率控制为 1 F D R 。 3结果与讨论 3 1 标准品含量与检 出肽段数 目的正相关性 离子信号强度和图谱数 目与蛋 白质含量的关系的研究较多 ， 发现蛋 白质被检测到肽段数 目与其含 量密切相关， 因此在不同体系中的同一蛋白质， 其肽段的检出数 目 是其相对含量的一个最简单指标。本 研究考察 B S A， O V A和 L Y Z C在上样量从 1 f m o l 增至 1 p m o l 过程中被检测到的肽段数 目的变化。如图 1 A所示 ， B S A总量为 1 f m o l 时 ， 3次平行实验测得肽段数 目分别为 1 ， 1 和 3 ； B S A总量为 2 f m o l 时， 肽段 数 目为 3 ， 6和 6 ； B S A总量继续增加 2倍 ( 4 f m o 1 ) 时 ， 肽段数量变化不大 ， 分别 为 5 ， 5和 6 ； 但是当 B S A 第 3期 洪晓愉等：高分辨飞行时间质谱在蛋白质组学相对定量分析中的应用4 0 5 总量继续增加后 ， 肽段数 目均显著增加 ； 除在 6 4和 1 2 8 f mo l 有 1次检测到的肽段数均为 2 6个外 ， 在高 含量组所检测到的肽段数 目总是高于低含量组 ， 但在相同浓度组 内具有一定偶然性。在溶菌酶 C上也 观察到类似现象 ， 即被检测的肽段数 目随蛋 白质含量增加( 图 1 B) ， 但含量起 点升高 ， 即在 8 f mo l 含量 时 ， 在 3次实验 中只有 1 次检测到 1 个 肽段 ， 而从 1 6 f m o l 增至 6 4 f mo l 时， 肽段数量增加并不明显 ； 从 2 5 6 f mo l 增至 1 0 2 4 f m o l 时 ， 肽段数 目增加显著 。卵清蛋白的肽段数 目随浓度变化的趋势 ( 数据未给出) 与溶菌酶 C相近 ， 在 1 6 f m o l 时 ， 有 1 个肽段检出； 含量高于 1 2 8 f mo l 时， 检 出肽段数 目显著增加。以上 结果表明， 对同一蛋白质而言 ， 在浓度超过一定阈值后 ， 其被检测到的肽段数 目与它的量具有正相关性 ， 该 阈值应与蛋 白质 的种类、 结构 、 其酶切肽段的化学性质和是否容易电离等因素有关。对于不 同蛋白质 不能简单 比对 ， 但同一蛋白质在不同体系中被检测到的肽段数 目差异反映了其含量的不同。此外 ， 肽段 的前体离子强度还可提供进一步的半定量分析信息。 _口 三 0 昌 j Z 图 1 蛋 白质上样量对检 出肽段数 目的影 响 Fi g 1 I n flue n c e o f p r o t e i n a mo un t s o n t h e nu mbe r o f de t e c t e d p e p t i de s ( A) 牛血清白蛋白 ( B) 溶菌酶 C 。 ( A)B o v i n e s e r u m a l b u mi n( B S A) ；( B)L y s o z y m e C ( L YZ C) 3 2标准品上样量与前体离子强度之和的相关性 用 c p s 表示离子强度 ， 考察 了蛋 白质所有检出肽段 的 c p s 值之和与其含量的关 系， 首先验证了 3种 蛋白质标准品的总离子强度之和 与其上样量 间的关 系。如图 2所示 ， B S A各肽段 的离 子强度之和在 1 1 0 2 4 f m o l 的上样量范围内与上样量呈线性关系， 回归系数为 0 9 8 5 ， 但 是在低上样量 ( 1 1 6 f mo 1 ) 时线性关系不好 ， 2与 4 f m o l 的信号相近。此外 ， 虽然 3次平行测定实验的标准偏差较大 ， 但在上样量 的递增过程 中， 所有梯度实验 的上样量 与离子强度信号之和都具有正相关性 ， 即可 以用 B S A各肽段离 子强度之和表示其含量。考虑到同一样品信号强度 的最高值与最低值之间的比值小于 1 5倍 ， 可以认 为如果在不同样品中某蛋 白质的总肽段信号强度之和变化超过 3倍 ( 极差) ， 则可以忽略仪器在测定过 0 2 o O 4 0 0 6 o O 8 0 o l O o o 1 2 0 o C ( f mo l 7 w L ) 图 2 牛血清 白蛋 白的标准 曲线 Fi g 2 St a n da r d c u r v e f o r BS A A：1 -1 0 2 4 f mo l ；B：1 1 6 f mo 1 舳 加 o 分 析 化 学 第 4 4卷 程 中色谱峰取点波动所产生 的影响 ， 认为含量有变化。对于卵清蛋 白和溶菌 酶 C也观察 到了类似关 系， 但线性范围较窄 ， 重现性亦较差 。 3 3 单 一肽 段离 子打 击数 与上样 量 的相关性 由以上的实验结果和分析可知， 蛋 白质被检测到的肽段数 目与上样量有关 ， 所 以使用肽段 的离子强 度之和表示蛋白质含量也会受到上样量的影响。对于 3种蛋 白质标准品 ， 所检测到肽段 的最小打击数 分别为 1 5 2 ， 1 6 4和 1 7 5 ， 进一步随机分析其它样品的数据 ， 发现被检测肽段的最低打击数约为 5 O ， 因此， 打击数 1 5 0已接近能够被检测的极限， 而只有打击数大于 1 0 0 0时才开始呈现较强 的浓度- 信号强度之 间的线性关系和较小 的随机误差， 而不同序列肽段质谱检测 的灵敏度不同， 此结果表 明， 可 以利用类似 S R M的方法选择最灵敏肽段进相对定量分析。 由图 3可见 ，以 B S A为例 ， 最先被检测到的酶切肽段为 L V N E L T E F A K， 并且在各组结果 中其离子 强度均为最高 ， 在进样量为 1 0 2 4 f mo l 时 ， 该肽段离子强度约 占总 5 7条肽段的总离子强度的 2 2 ， 用该 肽段进行定量分析 的效果优于使用离子强度之和 ， 回归系数为 0 9 9 6 。此外 ， 肽段 Q T A L V E L L K的定量 分析效果也较好 ， 回归系数 为 0 9 9 5 。在溶 菌酶 c中， 最 灵敏和 次灵敏肽段分别 为 G T D V Q A WI R和 N T D G s T D Y G I L Q I N s R， 它们在上样量 2 5 6 f mo l 时 c p s 值大于 1 0 0 0， 线性范围为 2 5 61 0 2 4 f m o l 。卵清蛋 白的最灵敏肽段为 L T E WT S S N V ME E R， 也是在 2 5 61 0 2 4 f m o l 时呈现稳定 的线性范 围。以上结 果说 明 ， 低浓度或低响应时 ， 由于电离的随机性和离子传输过程中的损失对响应信号的影响不可忽略 ， 而在 高浓度时这两种影 响的损失 占总离子的比重较小 ， 即可呈现较强 的线性关系。此外 ， 离心管和内插管等 容器对蛋 白质和多肽的吸附无法完全避免 ， 在蛋白质和多肽浓度较低时这些因素对分析结果的影 响相 对较大。因此 ， 如果蛋白质具有很灵敏的检测肽段 ， 用该肽段的离子强度表示蛋白质的含量更为准确 。 0 5 0 0 C S S A ( f mo 1 7 L ) 图 3 肽段 L V N E L T E F A K和 Q T A L V E L L K的标准 曲线 F i g 3 S t a n d a r d c u r v e s f o r p e p t i d e L V N E L T E F A K a n d Q T A L V E L L K 选择肽段时应注意 ， 蛋 白质序列的多样性也可能影响分析结果。例如 ， 肽段 Q T A L V E L L K还会发生 V端的焦谷氨酸化和丝氨酸的脱水 以及胰酶漏切肽段 K Q T A L V E L L K， 而肽段 K Q T A L V E L L K还会发生 端的甲酰化 、乙酰化和氨甲酰化 ， 这种序列的多样性对酶解过程 的平行性和酶的质量稳定性提出了 更高要求。此外， 有些肽段在浓度较高时还会发生钠离子化 。本方法不适于低质谱响应的蛋 白和肽 段 ， 在采用非数据依赖性采集技术 ， 如全部理论碎片离子 的连续窗 口采集( S WA T H) 技术 ， 有可能对 这些肽段更为有效 ， 但 S WA T H技术要求 4次质谱分析 ， 也 比较耗时。本研究表 明， 对于低浓度和低质 谱响应肽段 ， 无论采用哪种标记或非标定量分析方法 ， 都无法完全避免生物学吸附和质谱分析过程中的 不 确定 性 。 4 结 论 利用 T r i p l e T O F 5 6 0 0高分辨质谱仪 ， 分析牛血清白蛋 白等 3种蛋白质标准品 ， 研究了质谱离子强度 与蛋 白质样 品相对含量的相关性 。结果表明 ， 蛋 白质浓度或上样量的增加与肽段检出数量、 肽段 c p s 数 和总肽段 c p s 数 目之和具有正相关性 ， 但线性范围起点的 c p s 数要超过 1 0 0 0 ， 否则样品在 电离 和离子传 第 3期 洪晓愉等 ： 高分辨飞行时间质谱在蛋 白质组学相对定量分析中的应用 4 0 7 输阶段的损失不能忽视 。平行实验结果表明， 当 c p s 数大于 1 0 0 0时， 同一肽段在 3次测量 中 c p s 的波动 一 般在 0 51 5倍之间 ， 将所有肽段 c p s 数求和可降低波动值。以上结果表 明， 当不 同样 品中相同蛋 白质的总离子强度之和的变化值超过 3倍 ， 并结合检出肽段数 目， 可 为蛋 白质半定量分析 比较提供参 考 ， 而利用最灵敏肽段可提供更准确的定量分析关系。 Re f e r e nc e s 1 Y a t e s J R， Wa s h b u r n M P A n a 1 C h e m ， 2 0 1 3 ， 8 5 ( 1 9 ) ： 8 8 8 1 2 mt h s J A n a 1 C h e m ， 2 O 0 7 ， 7 9 ( 1 7 ) ： 6 4 5 1 6 4 5 4 3 L 0 J N，M a S P ，Z h a n g x F ， Z h e n g L J ， Ma Y H， Z h a o X Y，L a i W J ， S h e n H Y，Wa n g Q s ， j i J G P r o t e o m ， 2 0 1 41 1 0 ( 3 )：4 5 5 8 4 A h e l a a r A F ， Mu n o z J ， H e c k A J N a t R e v G e n e t ， 2 0 1 3 ， 1 4 ( 1 ) ： 3 5 - 4 8 5 T e r a mo t o R，Mi n a g a w a H， H o n d a M，Mi y a z a k i K，T a b u s e Y，K a mi j o K，U e d a T ，K a n e k o S B i o c h i mB i o p h y s A c t a ， 2 o o 8 ，1 7 8 4 ( 5 ) ： 7 6 4 7 7 2 1 O 11 1 2 1 3 1 4 1 5 1 7 1 8 U c h i d a Y，O h t s u k i S ， K a t s u k u r a Y， I k e d a C， S u z u k i T ， K a m i i e J ， T e r a s a k i T N e u r o c h e m ， 2 0 1 1 ，1 1 7 ( 2 ) ： 3 3 3 3 4 5 N i e A Y， Z h a n g L ， Y a n G Q， Y a o J ， Z h a n g Y， L u H J ， Y a n g P Y， H e F C A na1 C h e m ， 2 0 1 1 ， 8 3 ( 1 5 ) ： 6 0 2 6 6 0 3 3 T i a n R J ， Wa n g S ， E l i s m a F ， L i L ， Z h o u H， Wa n g L S ， F i g e y s D Mo 1 C e l l P r o t e o m ， 2 0 1 1 ，1 0 ( 2 ) ：M1 1 0 0 0 0 6 7 9 S u d h i r P R，C h e n C H，P a v a n a Ku ma fi M，Wa n g M J ， T s o u C C，S u n g T Y，C h e n J Y， Ch e n C HMo 1 C e l l Pr o t e o m ， 2 0 1 2 1 1 ( 1 0 ) ： 9 0 1 9 1 5 C h a h r o u r 0，C o b i c e D，Ma l o n e J J P 0 ， mBi o me d A na 1 ， 2 0 1 5，1 1 3：2 2 O Ma t r o s A， K a s p a r S ， Wi t z e l K， Mo c k H P P h y t o c h e m i s t r y ， 2 0 1 1 ， 7 2 ( 1 0 ) ： 9 6 3 - 9 7 4 Z H U J i n L e i ，Z H A N G K a i ，H E X I We n ， Z HA N G Y u K u i C h i n e s e A n a 1 C h e m ， 2 0 1 0 ， 3 8 ( 3 ) ： 4 3 4 4 4 1 朱金蕾 ， 张 锴，何锡文，张玉奎分析化学， 2 0 1 0 ， 3 8 ( 3 ) ： 4 3 4 4 4 1 L a n u c a r a F，Ey e r s C E Me t h o d s i n En z y mo l o g y ， S a n D i e g o：E l s e v i e r Ac a d e mi c P r e s s I n c 2 0 1 1， 5 0 0：1 3 3 1 5 0 D e p h o u r e N，G y g i S P S c i S ig n a 1 ， 2 0 1 2， 5 ( 2 1 7 ) ： r s 2 WU P e n g ， H e F u C h u ， J I A N G Y i n g P r 0 g B i o c h e mB i o p h y s ， 2 0 1 3 ， 4 0 ( 3 ) ： 2 8 1 2 9 2 武 鹏，贺福初 ， 姜 颖生物化学与生物物理进展 ， 2 0 1 3， 4 0 ( 3 ) ： 2 8 1 2 9 2 Z HAN G We i Ch i n e s e A n a 1 C h e m， 2 0 1 4， 4 2 ( 1 2)：1 8 5 9 1 8 6 8 张 伟分析化学 ， 2 0 1 4 ， 4 2 ( 1 2 ) ： 1 8 5 9 - 1 8 6 8 C l a r k e D J ， C a m p o p i a n o D J A nal y s t ， 2 0 1 5 ，1 4 0 ( 8 ) ： 2 6 7 9 - 2 6 8 6 S c h u b e r t O T，Gi l l e t L C，C o l l i n s B C，Na v a =o P，Ro s e n b e r g e r G，W o l s k i W ，L a m H ，Amo d e i D ，Ma l l i c k P，Ma c L e a n B， A e b e r s o l d R N a t P r o t o c ， 2 0 1 5 ， 1 0 ( 3 ) ： 4 2 6 4 4 1 App l i c a t i o n o f Hi g h Re s o l u t i o n Ti m e o f - Fl i g h t M a s s Sp e c t r o s c o p y i n Re l a t i v e Qu a n t i t a t i v e An a l y s i s i n P r o t e o mi c s HONG Xi a o Yu ，WANG Ha o ，XU J i n L i n g ，L I S h u i Mi n g ，WANG Yo n g 。 ( C o l l e g e o fL if e S c i e n c e ， S h e n z h e n K e y L a b o r a t o r y of Mi c r o o r g a n i s m， S h e n z h e n U n i v e r s i t y ， S h e n z h e n 5 1 8 0 6 0 ，C h i n a ) ( C o l l e g e of S c i e n c e ， S h e n z h e n K e y L a b o r a t o r y of M a r i ne B i o r e s o u r c e s a n d E c o l o g y ， S h e n z h e n U n i v e r s i t y ， S h e n z h e n 5 1 8 0 6 0 ， C h i na ) Abs t r a c t By u s i n g t h e h i g h r e s o l u t i o n ma s s s p e c t r o me t e r Tr i p l e TOF 5 6 00，t h r e e k i n d s o f s t a n da r d p r o t e i n s i n c l u d i n g b o v i n e s e r u m a l b u m i n( B S A) ， o v alb u m i n( O V A)a n d l y s o z y me C ( L Y Z C )w e r e a n a l y z e d ， a n d t h e c o r r e l a t i o n s hi p be t we e n t h e i o n i nt e n s i t y o f ma s s s pe c t r o me t r y a n d t h e r e l a t i v e c o n t e n t o f p r o t e i n s a mpl e wa s i n v e s t i g a t e d T h e p r o t e i n s a mp l e s w e r e d i g e s t e d b y t r y p s i o n a n d d i l u t e d t o 1 1 0 2 4 f mo l i n 7 t x LT h e i o n c o u n t s p e r s e c o n d ( c p s )w e r e u s e d t o s t a n d f o r t h e a mo u n t s o f p r o t e i n s a n d p e p t i d e s T h e n t h e c o r r e l a t i o n b e t w e e n s u m o f i o n i n t e n s i t y( c p s )o f a l l t h e p e p t i d e s ， n u m b e r o f p e p t i d e s d e t e c t e d a n d t h e a mo u n t o f p r o t e i n s 4 0 8 分 析 化 学 第 4 4卷 wa s i n v e s t i g a t e dBy c o mp a r i n g t h e c h a n g e o f v a l u e s o f t h e s a me s a mp l e i n t h r e e p a r a l l e l e x p e rime n t s ，a l i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t we e n t h e s e i nd e x e s a n d t h e a mo u n t o f p r o t e i n s wi t h i n 1 1 0 2 4 f mo l wa s fou n d wh e n t h e c p s wa s mo r e t h a n 1 0 0 0 Us u a l l y，t h e ma x i ma l i o n i n t e n s i t y wa s n o mo r e t h a n 1 5 t i me s o f t h e mi n i mu m v a l ue f o r s a me p e p t i d e i n t rip l i c a t e e x p e r i me nt s，wh i c h s u g g e s t e d t ha t t h e 3 t i me s o r mo r e c h a n g e o f i o n i n t e n s i t y wa s t h e mi n i mum t h r e s h o l d t o d e t e r mi ne t he d i f f e r e n c e s o f p r o t e i ns a mo u n t s i n di f f e r e n t s a mpl e s T hi s s t ud y pr o v i d e s a r e l a t i v e q u a n t i t a t i v e a na l y s i s me t h o d u s i n g q u a l i t a t i v e d a t a o f h i g h r e s o l u t i o n a n d h i g h s c a n s p e e d ma s s s p e c t r o me t r y，wh i c h c a n q u i c k l y a n d e a s i l y p r o v i d e r e f e r e n c e for b i o l o g i c a l a n d me d i c a l r e s e a r c h K e y w o r d s Q u a n t i t a t i v e p r