限制性内切酶.ppt

DNA 分子克隆,Contents,. DNA 分子克隆的基本原理,基因（gene）一段DNA或RNA顺序。该顺序可以产生或影响某种表型（genotype，phenotype），代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。 基因工程（genetic engineering）在体外通过人工剪、接，将不同来源的DNA分子组成一个杂合DNA分子(DNA分子重组体)，然后导入宿主细胞去复制扩增或表达。因为通过人工设计,得到一定的设计方案，故称为基因工程。由于整个操作在分子水平上进行，所以也称分子克隆。 基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达。,在这个过程中： 1.“基因剪刀” 剪取DNA的酶就像一把“基因剪刀” 2.“缝纫针” 连接不同来源DNA分子的酶就像一根“缝纫针”，使二者连在一起 3.“交通工具” 使用载体好比一辆车子 4.“乘客” 有用基因如IL2好比是乘客，车子把乘客送进理想天堂（宿主细胞）去繁衍生息，春华秋实，生产我们需要的产品或开展基因治疗（IL2/LAK抗癌）。,基因工程技术的特点 不受亲缘关系的限制。 如人胰岛素导入细菌 可以定向的改变生物的遗传性。如转基因大豆 增加目的基因的剂量。如治疗艾滋病的白介素12,我们应该记住他们 （1）.第一个实现DNA重组的人Berg 1972年，Berg用E.coR切割SV40DNA和phageDNA，经过连接组成重组的DNA分子。Berg是第一个实现DNA重组的人。 （2）.第一个取得基因工程成功的人Cohen 1973年，Cohen Group将E.coli的tetr（四环素）质粒psclol和nersrR6-3质粒Rb-3体外限制酶切割，连接成一个新的质粒，转化E.coli，在含四环素和新霉素的平板上筛选出了terrNer,实现了细菌遗传性状的转移。这是基因工程史上的第一个克隆转化并取得成功的例子，这一年被定为基因工程诞生的元年,Cohen Group第一次实现了细菌遗传性状转移示意图,2.用于基因克隆的工具酶,工具酶现已商品化。,DNA限制性内切核酸酶,“基因剪刀”限制性内切酶（restriction endonadease) () 发现 （1）20世纪4060年代，科学家们就为基因工程设计了美好的蓝图，但是面对庞大的dsDNA（104，2.2*1011公里）束手无策，无从下手把它切成单个基因片断 （2）当时的酶学知识已有相当的发展，但是没有一个已发现的酶能完成这样的使命。 （3）1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌（Haemophilus inffuenzae）分离纯化了Hind，取得了突破，打破了基因工程的禁锢，迎来了改造生物的春天，为基因工程奠定了最为重要的技术基础。,() 定义 是一类专门切割DNA的酶，它们能特异结合一段被称为限制酶识别顺序的特殊DNA序列。并切割dsDNA。 所谓限制（restriction）=切割（clearage）=水解（hydrolysis）该部位的核苷键（磷酸二酯键）,共同的特性： 只切割双链DNA分子，不切单链DNA； 每种酶有其特定的核苷酸序列识别特异性； 需要镁离子激活等。,()分类限制酶都是从原核生物中发现的。所有的限制酶可分成3类。 a 型 多亚基 双功能酶（由同一个酶完成） S（识别） ,M（甲基化），R（限制酶） b 型 修饰限制由两个酶完成。识别回文序列。 C III型 两个亚基 双功能酶。M （识别与修饰）R（切割),() 命名（1973年Smith 原则、型酶） 属名前的第一个字母（大写）-种名前两个字母（小写）-株名-有变种或品系的第一个字母（大写）-发现次序（、）,如EcoR是指从大肠杆菌（Escherichia coli）R株分离得到的第一种限制酶。,().识别位点（或切割位点）：识别的特殊DNA序列 一般特征（2点）： a识别序列呈回文对称46bp并水解该部分的核苷键,5- GAATTC-3 3- CTTAAG -5,EcoR的识别序列,Hae的识别序列,5- GTTAAC-3 3- CAATTG -5,5NNNNNG 3NNNNNCTTAAp,5NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3 3NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5,EcoR的识别序列和酶切切口5（粘端） cohensive end,pAATTCNNNNNN3 GNNNNNN5,b 酶靶顺序大小是很重要的，它决定产生特定DNA片段的大小。 若DNA碱基组成是均一的，限制酶切点是随机的，那么对于： 要求4bp靶序列如Hpa,Mbo等在庞大DNA链上平均44核苷酸即可遇到一个靶序列，即1/256 同理，要求6bp的酶，则平均46遇到一个靶序列，即1/4096,同裂酶(isoschizomers)：源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶 . 如： 识别顺序与切割方式同 Mbo 5和SauS 3（ NNGATCNN-3）-NNCTAGNN-5 识别与切割相同，但其中一酶可以 “修饰”（甲基化*），另一酶不能。如： HpaCCGG MspCCG*G MboGATC Sau 3AGA*TC,C 一个位点包含在另一个位点之中（称subsets-识别与切割相互有关的酶称之。） Hpa CCGG Sma CCCGGG Sma的6个bp含Hpa的4个bp顺序，所以Hpa能识别与切割Sma的6个bp，但含有Hpa的ccgg其它6核苷酸顺序不能被Sma切割。 同尾酶（isoaudumers-识别顺序不同，产生粘性末端相同的酶称之。） BamH GGATCC Sau 3 A NGATCN 由此产生的DNA片段可借粘性末端相互连接，在DNA重组时具有更大的灵活性。,().应用： 1DNA重组 2.分子杂交受体片段DNA 3.DNA 序列分析 4.制备DNA探针 5.基因定位DNA 6.DNA甲基化碱基的识别和切割 7.组建新质粒,().DNA物理图谱标明限制酶在DNA分子上的限制位点数，限制性片段的大小及排列顺序的图谱称之或称限制性图谱。组建图谱是基因工程的第一步工作与基因定位，转录，消化，分离，分子杂交，克隆转化有直接的关系。,DNA聚合酶,1.作用机理：DNA聚合酶的作用是将一个脱氧核苷酸加到DNA的3上，再释放出一焦磷酸分子。 大肠杆菌的DNA聚合酶（,) 2.常用的有三种 T4噬菌体DNA聚合酶 嗜热水生菌DNA聚合酶,I 大肠杆菌的DNA聚合酶（,) ii T4噬菌体DNA聚合酶 来源： 源于T4噬菌体感染的E.coli。 酶的活性：相似于Klenow（经枯草杆菌蛋白酶水解可获 得）片段，但远远强于Klenow片段 （1）53 聚合活性， （2）35 外切酶活性（T4 pol/Klenow）,Iii 嗜热水生菌DNA聚合酶 来源： 1969年在美国黄石公园温泉分离出一种嗜热真菌，即水生栖热菌株，已经克隆化该菌的基因，cetus公司首次分离纯化了该酶，商品名为Taq DNA polymerase，分子量94KD，20至少可贮存6个月，由于Taq DNA polymerase能抵抗链分离所需要的高温（9495）的反复处理，故只需在第一次热变性后，加一次酶，即可以进行3040次循环，简化加快了操作程序，实现了PCR（ polymerase chain reaction）的自动化，耐热酶还有VENT、sac等，以Taq应用最广 酶的活性：这种酶再70-75人具有最高的活性 （1）53 聚合活性 （2）53 外切酶活性（T4 pol/Klenow）,常用T4DNA ligase. 功能：催化有互补顺序的两个dsDNA分子的粘性末端或平头末端3OH、5P连接作用。 来源噬菌体T4感染Ecoli分离的一种单链多肽酶 催化反应： （1）需要ATP、Mg2+作辅助因子 （2）缺刻（Nick）DNA也可作该酶的底物 （3）对粘性末端催化活性大于平头末端（酶量1：100）,DNA连接酶,几种重要的工具酶的酶学性质及在基因工程中的应用,分子克隆的载体与宿主系统,1.,载体：要把一个有用的基因（目的基因研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 如果没有合适的载体协助，外源性DNA很难进入受体细胞，即使能进入也不能复制和表达。,2.理想载体的基本条件：,1. 具有自主复制能力，使外源基因在受体细胞中 稳定遗传。 2. 含有多种限制酶识别的单一识别序列，有利于外源基因的 拼接插入。 3. 分子较小 4. 便于筛选和鉴定的选择标记（报告基因） 5. 使用安全,复制起始点,3.常用的有,质 粒,cosmid,噬菌体,M13,质 粒,质粒(plasmid ),Plasmid 独立于细菌染色体外的小型环状DNA分子。,Plasmid chromosome,（1）命名： 质粒和其他染色体外成分，如果是自然产生的质粒，用3个正体字母表示，第一个字母大写，如ColE1 ，但如果是重组质粒，则在两个大写字母之前加一个p，大写字母表示构建该质粒的研究者或单位。如pSC101（stanley cohen)及 pMT555 (menchester technology),（2）基本特性（6个） 自主复制性。,具有自己的复制起始位点 (Origing)(ori) 和控制复制频率的 控制基因 及编码基因，形成 独立复制子 (Replico) 结构。,可扩增性,严紧型质粒：复制需要蛋白质合成和DNA聚合酶的存在，复制于宿主细胞的增殖密切相关，每个宿主细胞由1-5个严紧型质粒 松弛型质粒：可以在没有蛋白质的情况下进行复制，每个宿主细胞内可存有10-200个以上的松弛型质粒，在细胞蛋白质合成及染色体复制停止的情况下，可大量扩增。因此，认为加入氯霉素抑制宿主菌蛋白质的合成，正是基于这个原理达到松弛型质粒的目的。,严紧型质粒(Stringent) 松弛型质粒( Relaxed),分为,可转移性 在天然条件下，野生型质粒通过细菌接合作用，从一个宿主细胞转移至另一个宿主细胞。而在实验条件下，质粒则通过转化过程进入受体细胞，这时的细胞处于感受态 ，细胞膜呈易于让小的DNA分子进入的状态。质粒进入受体细胞后，受体细胞可以因为质粒的进入产生新的表型。如出现对某种抗生素的抗性。这样就可以利用这种抗生素作为选择条件，筛选出阳性转化的受体细胞。 不相容性 相同 或 相似 复制子结构及特征的两种不同质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内， 这种现象称质粒的不相容性。,抗性,抗生素抗性基因： （genotype） 编码产物 功能（phenotype） （1）Ampr 酶 水解内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 1个膜蛋白 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 乙酰转乙酶 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之 失去毒性。 （4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物） 失活 （5）hygr 潮霉素磷酸转移酶 使潮霉素失活。,MCS多克隆位点（multiple cloining site，MCS） （1）MCS 是多个限制酶识别的一段DNA顺序，以便克隆/插入外源基因/DNA片段，与之相关概念有： （2）多聚接头（polyliker） 有些质粒载体单一切点少，不能普遍使用。为了扩大使用范围，可以加一段有许多限制酶识别的单一切点的多聚接头。 （3）人工接头（linker） 是用若干个bp组成的dsDNA片段，一般有一个或以上限制酶识别与切割的顺序。,（3）发展概况 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322。 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。 第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。,（4）载体的分类,（1）克隆载体（cloning vector） 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。 （2）表达载体（Expression vector） 具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。为了有效的转录，必需有强大的能够被宿主细胞识别的启动子，为了实现翻译，克隆基因必需有合适的SDs和RbS。这样一个基因表达需要的具有表达和调控能力的载体称表达载体。,载体的元件及性质,相对分子量小，易于纯化。 为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。可见其原型质粒在使用上有优点。 有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个，几乎具备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因的优越条件 具有抗性基因amp，tet,pBR322,特点,普通型载体pBR322的结构图,抗药性标志的选择,插入失活,pUC质粒系列也是在pBR322基础上改建成的。 它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和复制起始点。去除了pBR322的tetr区段，换用了M13噬菌体的476bp片段，含LacZ基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker.,pUC质粒系列,特点： 更小的分子量和更高的拷贝数（pUC8为2750bp） 可用组织化学方法检测重组体， Puc8含有LacZ基因所编码的肽链可参与互补，因此可用于蓝白筛选 具有MCS ,可以把具两种不同粘性末端的外源DNA片段直接克隆到pUC8质粒载体上,pUC质粒系列,大肠杆菌-半乳糖苷酶基因（LacZ）的启动子及其编码-肽链的DNA序列，称为LacZ基因。 位于LacZ基因中靠近5-端的一段多克隆位点区段，但并未破坏该基因的功能, 载体Puc系列（PUC18/19）含Lacz(N)即编码半糖苷酸N端的 146个AA信息也称多肽； Plac可以启动Lacz的 转录，表达，但受阻pr.阻遏，IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）能够去阻遏。 JM103受体菌含lacz(c)可以编码半乳糖苷酶的