映山红花总黄酮对大鼠海马神经元缺氧性损伤的保护作用及其对BKCa通道的影响.docVIP

分类号：密级：编号：U D C：学位论文映山红花总黄酮对大鼠海马神经元缺氧性损伤的保护作用及其对 BKCa通道的影响The effects of total flavones of rhododendra on rat hippocampal neuroninduced by anoxia-reoxygenation and its action on BKCa channel余小蒙指导教师姓名申请学位级别郭岩副教授陈志武教授安徽医科大学安徽医科大学硕士专业名称药理学提交论文日期2014-03论文答辩日期2014-05学位授予单位和日期安徽医科大学答辩委员会主席李庆林评阅人杨俊卿罗春霞2014年 05月 安徽医科大学硕士学位论文映山红花总黄酮对大鼠海马神经元缺氧性损伤的保护作用及其对 BKCa通道的影响The effects of total flavones of rhododendra on rat hippocampal neuroninduced by anoxia-reoxygenation and its action on BKCa channel作者姓名指导老师余小蒙郭岩陈志武药理学副教授教授学科专业研究方向论文工作时间心血管药理学2012年 9月至 2014年 3月2014年 05月 学位论文独创性声明本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明并表示谢意。学位论文作者签名：日期：学位论文使用授权声明本人完全了解安徽医科大学有关保留、使用学位论文的规定：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。愿意将本人的学位论文提交中国博士学位论文全文数据库、中国优秀硕士学位论文全文数据库和中国学位论文全文数据库中全文发表，并可以以电子、网络及其他数字媒体形式公开出版，并同意编入 CNKI中国知识资源总库，在中国博硕士学位论文评价数据库中使用和在互联网上传播。保密的学位论文在解密后适用本规定。学位论文作者签名：日期：导师签名：日期： 安徽医科大学硕士学位论文目 录英文缩略词表（abbreviation）.1中文摘要.2英文摘要.51.引言.82.实验材料.102.1实验动物.102.2药品与试剂.102.3仪器设备.113.实验方法.123.1大鼠海马神经元的原代培养.123.2海马神经元的鉴定.123.3海马神经元缺氧-再复氧损伤模型的建立.133.4实验分组.133.5 TFR对大鼠海马神经元 MTT吸光度值的影响.143.6 TFR对大鼠海马神经元培养上清液 LDH活力的影响.143.7 TFR对大鼠海马神经元培养上清液 MDA含量的影响.153.8 TFR对大鼠海马神经元培养上清液 NSE活力的影响.153.9 TFR对大鼠海马神经元凋亡的影响.163.10 Western blot检测 TFR对大鼠海马神经元 BKCa蛋白表达的影响. .163.11全细胞膜片钳记录.193.12统计学分析.214.实验结果.224.1海马神经元的培养与鉴定.224.2 TFR对海马神经元 MTT吸光度值的影响.234.3 TFR对细胞培养上清液中 LDH活力的影响.24 安徽医科大学硕士学位论文4.4 TFR对细胞培养上清液 MDA含量的影响.254.5 TFR对细胞培养上清液中NSE活力的影响.254.6 TFR对海马神经元凋亡的影响.264.7 TFR对海马神经元 BKCa蛋白表达的影响.284.8 TFR对海马神经元 BKCa电流的影响.294.8.1海马神经元 BKCa电流基本特征.294.8.2 IBTX对 BKCa电流的影响.304.8.3 TFR对海马神经元钙激活钾电流的影响.314.8.4 IBTX对 TFR引起的海马神经元外向钾电流增强效应的影响.335.讨论.345.1大鼠海马神经元的原代无血清培养.355.2 TFR对缺氧-再复氧大鼠海马神经元的保护作用355.2.1 TFR对大鼠海马神经元 MTT的影响.355.2.2 TFR对大鼠海马神经元 MDA含量及 LDH和 NSE活力的影响.355.2.3 TFR对大鼠海马神经元凋亡的影响.375.3 TFR对大鼠海马神经元 BKCa通道的影响.375.3.1 TFR对大鼠海马神经元 BKCa蛋白表达的影响375.3.2 TFR对大鼠海马神经元 BKCa电流的影响386.结论.39参考文献.40附录.45致谢.46综述及参考文献.47 安徽医科大学硕士学位论文英文缩略词表(Abbreviation)英文缩写4-AP英文名中文名4-aminopyridine4-氨基吡啶BKCaLarge conductance calcium-activatedpotassium channelsDimethyl sulfoxide大电导钙激活钾通道DMSOEDHFFBS二甲基亚砜Endothelium-derived hyperpolarizing factor内皮源性超极化因子Fetal bovine serum胎牛血清伊比利亚毒素钙激活钾通道乳酸脱氢酶微管相关蛋白 2丙二醛IBTXKCaIberiotoxinCalcium-activated potassium channelsLactate dehydrogenaseMicrotubule-associated protein 2MethylenedioxyamphetamineMilligramLDHMAP-2MDAmg毫克minMinute分钟MTTNOMethyl thiazoly ltetraZoliumNitric oxide噻唑兰一氧化氮NSEODNervous specific enolaseOptical density神经元特异性烯醇化酶光密度PBSPhosphate-buffered salineProstacyclin磷酸盐缓冲液前列环素PGI2SDSTBSTTFRWBSodiun dodecyl sulfateTris Buffered Salin TweenTotal flavones of rhododendraWestern blot十二烷基磺酸钠Tris缓冲盐水映山红花总黄酮免疫蛋白印迹1 安徽医科大学硕士学位论文映山红花总黄酮对大鼠海马神经元缺氧性损伤的保护作用及其对 BKCa通道的影响中文摘要目的：观察映山红花总黄酮（total flavones of rhododendra，TFR）对原代培养的大鼠海马神经元缺氧 -再复氧损伤的保护作用，以及大电导钙激活钾通道（ Largeconductance calcium-activated potassium channels，BKCa）在 TFR抗海马神经元缺氧-再复氧损伤中的作用，探讨 TFR抗缺血性脑损伤作用的机制。方法：1.取原代培养 68 d的大鼠海马神经元，采用免疫荧光法鉴定海马神经元微管相关蛋白-2（MAP-2）。2.取原代培养 68 d的大鼠海马神经元，随机分为正常组、模型组、不同浓度 TFR预处理组。将海马神经元放入含有 94% N2、5% CO2及 1% O2的三气培养箱中缺氧 4 h，再正常培养 24 h，建立缺氧-再复氧损伤模型。（1）海马神经元复氧 24 h后，采用比色法检测 TFR对 MTT染色吸光度值的影响。（2）取海马神经元复氧 24 h后的培养上清液，检测 TFR对 MDA含量、LDH和 NSE活力的影响。（3）海马神经元缺氧复氧后，采用 Hoechst33258染色法检测 TFR对海马神经元凋亡率的影响。（4）应用大鼠海马神经元缺氧-再复氧损伤模型，采用 Western blot技术检测TFR对海马神经元 BKCa蛋白表达的影响。3.采用全细胞膜片钳技术，记录大鼠海马神经元 BKCa通道电流，观察 TFR对海马神经元 BKCa通道电流的影响。2 安徽医科大学硕士学位论文结果：1. MAP-2免疫荧光结果显示，原代培养的大鼠海马神经元胞体和轴突有绿色荧光，视野下可观察到少许非特异性染色，无其他背景细胞染色，证实培养的细胞为神经细胞。2. MTT结果显示，与正常对照组比较，模型组海马神经元 MTT吸光度值显著下降；与模型组比较，（3.7，11.1，33.3，100，300 mg/L）TFR预处理组海马神经元 MTT吸光度值显著上升（P0.01），并在一定的范围内呈浓度依赖性。3.与正常对照组比较，模型组海马神经元 MDA含量、LDH及 NSE活力显著上升；（3.7，11.1，33.3，100，300 mg/L）TFR预处理组海马神经元 MDA含量、LDH及 NSE活力显著降低（P0.01），并在一定的范围内呈浓度依赖性。4. Hoechst33258结果显示，正常对照组海马神经元凋亡率很低，而模型组海马神经元凋亡率显著增加（P0.05）；（33.3，100，300 mg/L）TFR能显著降低缺氧-再复氧损伤模型组海马神经元的凋亡率（P0.05）；（100，300 mg/L）TFR对缺氧-再复氧损伤模型组海马神经元 BKCa通道蛋白表达没有显著影响（P0.05）。6.全细胞膜片钳记录结果显示，原代培养的大鼠海马神经元上能记录到BKCa电流，此电流为一组快激活且不易失活的外向电流，并且此电流能被 BKCa通道特异性阻断剂 IBTX（100 nmol/L）所阻断；（33.3，100，300 mg/L）TFR可以显著增大此外向电流（P0.05），并在一定的范围内呈浓度依赖性；（33.3，100，300 mg/L）TFR引起的外向电流增强效应能被 BKCa阻断剂 IBTX（100 nmol/L）阻断，即 TFR可能是通过增加 BKCa电流而增加外向电流的。结论：1. TFR对原代培养的大鼠海马神经元缺氧-再复氧损伤有一定的保护作用。2. TFR可以促进大鼠海马神经元 BKCa通道开放，这可能是 TFR对缺血性脑3 安徽医科大学硕士学位论文损伤发挥保护作用的机制之一。关键词：映山红花总黄酮；海马神经元；大电导钙激活钾通道；膜片钳；细胞凋亡4 安徽医科大学硕士学位论文The effects of total flavones of rhododendra on rat hippocampal neuron induced by anoxia-reoxygenation and its action on BKCachannel Abstract Objective:To observe the protective effect of total flavones of rhododendra (TFR) againstprimary cultured hippocampal neuronal injury induced by anoxia-reoxygenation, andthe role of large conductance calcium-activated potassium channels (BKCa) in thiseffect.Methods:1. After the primary hippocampal neurons were cultured for 68 days, theimmunofluorescence of microtubule associated protein-2 (MAP-2) was used to identifyneurons.2. The cultured primary hippocampal neurons were randomly divided into normalgroup, model group and TFR preconditioning group with different concentration. Thehippocampal neurons were exposed to anoxia environment (cultured in 94% N2 + 5%CO2 + 1% O2 ) then reoxygenated for 24 h (cultured in aerobic environment).（1）At 24 h after reoxygenation, neuronal viability was assessed by MTTreduction assays, a spectrophotometric method.（2）At 24 h after reoxygenation, the content of malondialdehyde (MDA) andactivities of lactate dehydrogenase (LDH) and neuronspecific enolase (NSE) in culturesupernate were detected by spectrophotometric methods.（3）The apoptosis rate of hippocampal neurons after anoxia-reoxygenation wasidentified morphologically with Hoechst33258 dye by fluorescence microscope.5 安徽医科大学硕士学位论文（4）The BKCa channels protein expression were detected by Western blot analysison hippocampal neurons after anoxia-reoxygenation.3. The BKCa channel currents were recorded using the whole-cell patch clampconfiguration on cultured hippocampal neurons in rats, and effect of different doses ofTFR on BKCa channel was observed.Results:1. Following immuno-fluorescence, MAP-2 protein that is selectively distributed indendrites and cell bodies, was present in cultured hippocampal neuron. This resultdemonstrate that the cultured hippocampal cell is hippocampal neuron.2. The analysis of cell viability by the MTT method revealed that the absorbance ofhippocampal neuron was decreased significantly after anoxia-reoxygenation. TFRshowed a neuronal protective effect when used in the culture medium. TFR protectedneuronal death in a concentration-dependent manner, when 3.7300 mg/L TFR wereapplied, compared with the model group.3. The LDH and NSE activity and the content of MDA in supernate were increasedsignificantly at 24h after reoxygenation. TFR (3.7,11.1,33.3,100,300 mg/L) significantlyinhibited the increases of LDH and NSE activity and the content of MDA whencompared to the model group.4. At 24 h after reoxygenation, the nuclei of cultured neuron was stained withHoechst33258. Exposure of neuronal cultures to anoxia-reoxygenation significantlyinduce neuronal apoptosis. Application of TFR (33.3,100,300mg/L) could significantlyinhibit the percent of apoptotic nuclei on hippocampal neurons.5. After reoxygention the protein expression of BKCa channels did not change, andTFR (100,300 mg/L) has no significant effect on the protein expression of BKCa on thehippocampal neurons.6. The current of BKCa channels were recorded with whole-cell patch clamp oncultured hippocampal neurons, which was outward current and characteristic of high6 安徽医科大学硕士学位论文amplitude, quick activation and almost never inactivation. The current could be blockedby IBTX (100 nmol/L), a specific BKCa channel blocker. The current of BKCa channelswere increased significantly by TFR in a concentration-dependent manner at the dosesof 33.3300 mg/L. Moreover, the enhancement of the current of BKCa channels by TFRcould be blocked by IBTX (100 nmol/L).Conclusions:1. TFR has a certain protective effect on primary cultured hippocampal neuronalinjury induced by anoxia-reoxygenation .2. TFR can increase the open probability of BKCa channel, and this might be one ofthe possible mechanisms which TFR have protective effect on brain ischemic injury.Keyword: Total flavones of rhododendra/hippocampal neuron/large conductancecalcium-activated potassium channels/patch clamp/cell apoptosis7 安徽医科大学硕士学位论文映山红花总黄酮对大鼠海马神经元缺氧性损伤的保护作用及其对 BKCa通道的影响1引言脑血管疾病为神经系统常见疾病之一，据统计，每 15秒左右，全球就有一个人死于脑血管疾病。在脑血管疾病中以缺血性脑血管病最为常见。缺血性脑血管病具有高复发率、高致残率及高死亡率等特点，给病人带来了巨大痛苦，给家庭带来了沉重负担，其影响人群主要为老年人，随着人口老龄化趋势加剧，其发病率不断上升，已成为目前威胁人类生命的常见病1。目前用于预防和治疗脑缺血的药物效果不明显，因此，开发预防和治疗脑缺血疾病的有效药物已成为当前国内外医学研究的重点。映山红，又名杜鹃花，属杜鹃花科植物，映山红作为一种重要的中药资源，具有镇咳，祛痰，平喘，强心等作用，其功效在本草纲目中亦有记载。映山红花总黄酮（total flavones of rhododendra，TFR）是从植物映山红花中提取的主要部位之一，其有效成分为金丝桃苷等黄酮类化合物。本课题组前期实验证实，金丝桃苷对脑缺血损伤有明显的保护作用，其保护机制与抑制细胞内 Ca2+超载有关2-5。本实验室前期在大鼠脑缺血-再灌注损伤动物模型上，发现 TFR对缺血性脑损伤有明显的保护作用6，其机制与 TFR诱导的大鼠脑基底动脉内皮源性超极化因子（Endothelium-derived hyperpolarizing factor，EDHF）介导的血管舒张作用有关7。EDHF是由血管内皮细胞释放产生的非前列环素（Prostacyclin，PGI2）非一氧化氮（Nitric oxide，NO）的第三种舒血管因子8。研究表明，一些天然的或合成的黄酮类化合物发挥血管舒张作用主要与 EDHF有关，如大豆甙元可诱导 EDHF介导的雄性大鼠体外动脉血管松弛作用9，三羟异黄酮可有效抑制大鼠主动脉平滑肌细胞内皮依赖性超极化舒张反应的减弱 10。本课题组前期实验证实，金丝桃苷8 安徽医科大学硕士学位论文的血管舒张作用与促进 EDHF释放有关11，并且 TFR可使脑缺血再灌注大鼠基底动脉产生 EDHF诱导的血管舒张反应。EDHF由血管内皮细胞介导产生后，可开放平滑肌细胞膜上的钙激活钾通道（Calcium-activated potassium channels，KCa），增加钾离子外流，导致平滑肌细胞膜电位超极化，抑制 Ca2+通道开放，降低细胞内游离 Ca2+浓度，从而舒张血管，阻断 KCa通道能明显抑制血管的 EDHF舒张现象12-13。由动作电位和细胞内 Ca2+浓度影响通道开放及关闭的一类钾通道称为KCa14，KCa是钾离子通道家族重要成员之一，根据其 K电流特性及药理特性的差异至少可分为 3个亚型 15-16：小电导 KCa通道（ KCa2.3或 SKCa）；中电导 KCa通道（KCa3.1或 IKCa）；大电导 KCa通道（KCa 1.1或 BKCa）。其中 BKCa作为 KCa的主要亚型，具有电导值大，电压和 Ca2+依赖性等多种特征 17。研究证实，在神经元上 BKCa分布广泛 18-20。BKCa对维持神经细胞静息膜电位，调节其兴奋性起着关键作用。激活 BKCa通道，可产生 BKCa电流，BKCa电流影响动作电位超极化和复极化，并且调控着神经元的放电类型和放电频率，从而掌控着神经元的多种功能18。在血管平滑肌细胞中，去极化所致的钙离子内流会激活肌浆网肉桂碱敏感性钙离子通道释放钙火花，进而激活 BKCa通道，使细胞膜发生超级化，关闭钙离子通道，阻止钙内流。因此认为在血管平滑肌中，BKCa通道在反馈调节钙离子浓度上起重要作用。在神经细胞中，BKCa通道与钙离子也有紧密关系。研究表明，在缺血早期，胞内 Ca2+浓度上升导致 BKCa通道激活，抑制电压依赖性钙通道开放，从而减少 Ca2+内流。推测在神经细胞损伤的早期，BKCa通道起到了一定的代偿作用，其开放对于预防钙超载，促进细胞膜稳定发挥了一定的作用。既然 TFR可通过促进 KCa开放来舒张脑血管，那么我们推测 TFR对 KCa也有影响。所以本课题首先证实 TFR对缺氧-再复氧海马神经元有保护作用，并采用Western-blot技术检测 TFR对海马神经元 BKCa通道蛋白表达的影响，同时采用全细胞膜片钳技术研究 TFR对海马神经元 BKCa通道的作用，进一步探讨 TFR发挥缺血性脑损伤保护作用的机制，从而为临床防治脑血管疾病开拓更有效的途径。9 安徽医科大学硕士学位论文2实验材料2.1实验动物SD成年大鼠和出生 24 h内的 SD乳鼠，普通级，均购自安徽医科大学实验动物中心，实验动物合格证号：SCXR(皖)2011-002，实验室饲养温度：22左右。2.2药品与试剂TFR由安徽合肥合源医药股份科技有限公司提供，总黄酮含量达 85%以上。L-多聚赖氨酸(15万30万单位)：Sigma公司；DMEM/F12：Gibco公司，批号：8112315；胎牛血清（FBS）：Hyclone，批号：NWC0388；胰蛋白酶：碧云天生物技术研究所，批号：CD201；Neurobasal培养液：Gibco公司，批号：1237755；B27：Gibco公司，批号：1268476；谷氨酰胺（glutamine）：Sigma公司；微管相关蛋白 2（MAP-2）一抗：北京博奥森生物有限公司；FITC标记的荧光二抗：北京中杉金桥生物技术有限公司；抗荧光碎灭剂：碧云天生物技术研究所；伊比利亚毒素（IBTX）：Tocris Bioscience，批号：79133；4-氨基吡啶（4-AP）：Sigma公司，批号：04609HRV；噻唑兰（MTT）：碧云天生物技术研究所；乳酸脱氢酶（LDH）：南京建成生物工程研究所；批号：A-0201；丙二醛（MDA）试剂盒：南京建成生物工程研究所；批号：A003-1；神经元特异性烯醇化酶（NSE）试剂盒：南京建成生物工程研究所；批号：1030；二甲基亚枫（DMSO）：Sigma公司，批号：D5879；BCA蛋白定量试剂盒：碧云天生物技术研究所，批号：P0010S；细胞裂解液：碧云天生物技术研究所；蛋白酶抑制剂：碧云天生物技术研究所;10 安徽医科大学硕士学位论文上样缓冲液：碧云天生物技术研究所;SDS-聚丙烯酰胺凝胶：碧云天生物技术研究所;Hoechst33258：Sigma公司；其余化学试剂为 AR级国产分析纯。部分试剂容量大且反复冻存易降解，应分装后冻存于-20。部分试剂容量小不易称量，应直接配成高浓度母液，临用前稀释。试剂的保存应严格按说明书进行。2.3仪器设备Olympus CHL2FM3型倒置显微镜：日本 OLYMPUS公司；5%CO2恒温培养箱：Heal Force公司；数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；超速低温离心机：德国 Sigma公司；TGL-16H型高速离心机：珠海黑马仪器有限公司；XDS-1B型倒置显微镜：重庆光电仪器有限公司；FA1004型电子天平：上海天平仪器厂；电泳仪：美国 Bio Rad公司；DYCZ - 24D电泳槽：北京六一仪器厂；脱色摇床：北京六一仪器厂；转移电泳槽：Invitrogen公司；SpectraMax190型酶标仪：美国 Molecular Devices公司；全自动立式灭菌高压锅：上海博讯实业有限公司；PHS-3C型 pH计：上海雷磁创益有限公司；BX-51荧光显微镜：日本 OLYMPUS公司；微电极操纵器：日本 Narishige公司；PN-30型微电极拉制仪：日本 Narishige公司；EPC-10放大器：德国 Heka公司；玻璃毛坯：南京泉水教学器材厂。11 安徽医科大学硕士学位论文3实验方法3.1大鼠海马神经元的原代培养21-22所有操作应遵循人道主义原则，尽量减少动物的痛苦。所有操作在超净工作台中进行，确保无菌。将出生 24 h内的 SD乳鼠，放入含 75%乙醇的小烧杯中浸泡 1 min，消毒皮肤，断头后用眼科剪分层剪开皮肤和颅骨，再用眼科镊轻轻取出两侧大脑，放入无菌的含冰 PBS液的玻璃皿中，用眼科镊分别剥离两侧海马组织（前后以视交叉-乳头体为界，侧界以左右下丘脑沟为准，深度约 1.5 mm），剔除血管和筋膜等组织，转移到含有 0.125%胰蛋白酶的青霉素瓶中，用眼科剪将海马组织剪碎成约 1 mm3的小块；放入含 5% CO2的 37培养箱消化约 20 min，期间每 10 min振荡 1次；消化完毕后，加入与胰蛋白酶同等体积的 DMEM/F12完全培养基（DMEM/F12 + 10% FBS）终止消化后，轻柔吹打，再经孔径为 200目的滤布过滤；于 900 r/min离心 5 min，弃上清，再加入适量的 DMEM/F12完全培养基，轻柔吹打，再次离心 800 r/min，3 min，弃上清，加入种植培养基 DMEM/F12完全培养基，轻柔吹打呈细胞混悬液，用计数板镜下计数，并根据不同实验相应调整细胞密度，接种于事先用多聚赖氨酸处理过的培养皿 6孔培养板或 96孔培养板中；置于 5% CO2，37培养箱培养；1 d后用 Neurobasal完全培养液（Neurobasal +2%B27 + 0.5 mmol/L glutamine）换液以纯化培养的神经元，以后每隔 2 d换 1次液，根据细胞状态选择半量或全量换液，期间在显微镜下观察细胞状态，培养 68 d后可用于实验。3.2海马神经元的鉴定23-24取爬片培养 68 d的海马神经元，吸弃培养液，用 PBS清洗培养孔 1次；用4%多聚甲醛室温固定 10 min；吸弃甲醛，用 PBS洗 3次，每次约 5 min；吸弃 PBS，加入浓度为 0.3% Tritonx-100（PBS稀释）作用 30 min，将细胞打孔；弃掉Tritonx-100，用 PBS洗 3次，每次约 5 min；滴加封闭液（10%正常山羊血清工作液），于 37封闭 30 min；滴加稀释倍数为 1:100的一抗（用封闭液配制），将培养皿放入含有湿毛巾的饭盒里，4过夜；第 2天用 PBS洗 3次，每次 5 min；滴12 安徽医科大学硕士学位论文加稀释倍数为 1:100的二抗(以封闭液配制)，在室温条件下放置 1 h，用 PBS洗 3次，每次 3 min，避光条件下，滴加一滴抗荧光淬灭剂于载玻片中央；于荧光显微镜下观察细胞染色情况。3.3海马神经元缺氧-再复氧损伤模型的建立25取培养 68 d成熟的海马神经元，吸弃培养液，换 D-Hanks液（KCl 0.4 g，NaCl8.0 g，Na2HPO412H2O 0.51 g，NaHCO3 0.35 g，KH2PO4 0.06 g，调 pH至 7.27.4），置含 94% N2，5% CO2和 1% O2的三气培养箱中缺氧 4 h，缺氧完成后将 D-Hanks液更换为原培养液，再放回 5% CO2恒温培养箱中培养 24 h。3.4实验分组（1）MTT、LDH、MDA及 NSE检测分组：正常对照组：正常环境中培养 68 d的海马神经元，不缺氧；模型组：吸弃原培养液，换 D-Hanks液，置缺氧环境（94% N2，5% CO2和 1 %O2）中缺氧 4 h后再换回原培养液正常培养 24 h；缺氧液和复氧液中均加入 TFR，使其终浓度为 3.7 mg/L；缺氧液和复氧液中均加入 TFR，使其终浓度为 11.1 mg/L；缺氧液和复氧液中均加入 TFR，使其终浓度为 33.3 mg/L；缺氧液和复氧液中均加入TFR，使其终浓度为 100 mg/L；缺氧液和复氧液中均加入 TFR，使其终浓度为300 mg/L。（2）Hoechst33258染色法分组：正常对照组：正常环境中培养 68 d的海马神经元，不缺氧；模型组：将原培养液换为 D-Hanks液，放入缺氧环境（94% N2，5% CO2和 1% O2）中缺氧 4 h后再换回原培养液正常培养 24 h；缺氧液和复氧液中均加入 TFR，使其终浓度为 33.3 mg/L；缺氧液和复氧液中均加入 TFR，使其终浓度为 100 mg/L；缺氧液和复氧液中均加入 TFR，使其终浓度为 300 mg/L。（3）Western blot法分组：正常对照组：正常环境中培养 68 d的海马神经元，不缺氧；模型组：吸弃原培养液，换 D-Hanks液，置缺氧环境（94% N2，5% CO2和 1% O2）中缺氧 4 h后再换回原培养液正常培养 24 h；缺氧液和复氧液中均加入 TFR，使其终浓度13 安徽医科大学硕士学位论文为 100 mg/L；缺氧液和复氧液中均加入 TFR，使其终浓度为 300 mg/L。3.5 TFR对大鼠海马神经元 MTT吸光度值的影响基本原理：MTT法又叫 MTT比色法。MTT作为一种外源性黄色染料，可以被活细胞线粒体内膜的结合酶琥珀酸脱氢酶（ SDH）还原为不溶于水的沉积于细胞中的蓝紫色结晶状产物甲瓒（Formazan），而 MTT对死细胞无此功能，用 DMSO溶解细胞中的 Formazan后，用酶标仪（=490 nm）测定其吸光度值，可间接反映细胞活力。在细胞数一定时，MTT吸光度值与细胞活力成正比。步骤：取缺氧 4 h复氧 24 h的细胞，完成培养前 4 h吸去培养液，向每孔加入0.5% MTT液使每孔终浓度为 0.5 g/L，置于培养箱中继续孵育 4 h。加入适量 DMSO溶解 Formazan后，用酶标仪（=490 nm）测定各孔吸光度值（OD值）。MTT易分解，加 DMSO前应避光操作。3.6 TFR对大鼠海马神经元培养上清液 LDH活力的影响检测原理：LDH，又叫乳酸脱氢酶，它能促进乳酸生成丙酮酸（CH3COCOOH），CH3COCOOH与 2.4-二硝基苯肼发生反应，生成在碱性溶液中呈棕红色的化学物质丙酮酸二硝基苯腙，通过比色能得出 LDH活力。15 ml离心管 15 ml离心 15 ml离心管 15 ml离心管（标准管）0.05管（测定管）（对照管）（空白管）双蒸水2 mmol/l标准液待测样本0.050.30.250.250.250.050.250.25基质缓冲液辅酶 1应用液0.250.252.50.250.252.5混匀，37水浴 15 min2,4-二硝基苯肼（ml）0.250.25混匀，37水浴 15 min0.4 mol/LNaoH(ml)2.52.514 安徽医科大学硕士学位论文混匀，室温下放置 3 min，取各组细胞上清液，用酶标仪（=440 nm）测定各孔 OD值。血清中 LDH活力=(测定 OD-对照组 OD)/(标准 OD-空白组 OD) 2mmol/L(标准品浓度) 样品测试前稀释倍数1000。相关试剂的配制及操作注意事项严格参照 LDH试剂盒说明书进行。3.7 TFR对大鼠海马神经元培养上清液 MDA含量的影响检测原理：MDA即丙二醛，其为一种过氧化脂质类降解物，MDA在酸性条件下加热可与硫代巴比妥酸反应，生成红色物质，此物质在 532 nm波长下有最大吸收峰。15 ml离心管(测定管)15 ml离心管15 ml离心管（标准管）0.115 ml离心管（对照管）（空白管）10 nmol/ml标准品（ml）无水乙醇（ml）测试样品（ml）试剂一（ml）0.10.10.10.10.10.10.1混匀3试剂二（ml）试剂三（ml）冰醋酸（ml）3131311混匀器混匀，离心管管口用保鲜膜封紧，用针头刺一小孔，恒温水浴（95）40 min左右，取出后用流水冷却，然后离心 10 min (3 5004 000 r/min)，取各组细胞上清液，用酶标仪（=440 nm）测定各孔 OD值。血清中 MDA含量=(测定 OD-对照组 OD)/(标准 OD-空白组 OD) 10 nmol/L(