拟步甲科部分种线粒体COI和核18SrDNA基因序列及分子系统学研究.doc

宁夏大学硕士学位论文拟步甲科部分种线粒体COI和核18SrDNA基因序列及分子系统学研究姓名：高学花申请学位级别：硕士专业：农业昆虫与害虫防治指导教师：于有志20080401摘要拟步甲（）是鞘翅目的一个较大的类群，全球已知个科多族多属约种，我国已知亚科族余属近种。此类群是地球上分布范围较广、种类极为丰富、形态十分复杂和生活类型极为多样的甲虫，被认为是鞘翅目昆虫中研究难度较人的一科。目前，国内外学者对拟步甲科昆虫的分类和系统发育关系已做了大量研究，但大部分工作都集中于形态学方面。有不少学者从不同角度研究了该科在鞘翅目中的分类地位，揭示了其与近缘科间的关系，并提出亚科和族的分类系统关系。本研究在依据外部形态分类鉴定及前人工作的基础上，以拟步甲的部分种类为研究对象从分子生物学角度入手来探讨其不同族，不同属以及不同种间的分子序列的差异，利用技术通过对拟步甲科部分种线粒体基因组的细胞色素氧化酶亚基和核糖体基因序列的研究，在分子水平上探讨这些类群的分类地位和亲缘关系，希望能为进一步完善拟步甲科的分类系统，揭示其系统发育及演化提供分子水平的依据。得到的结论如下：一、使用线粒体基因和基因片段序列分别对拟步甲科的部分种进行了系统发育分析，并对靶序列进行排序、比较、分析，计算核苷酸组成、变异位点和序列差异，并构建了分子系统进化树（，），确定各类群间的系统关系，验证了宏观形态分类学。结果表明分子研究和传统的分类研究结果基本一致。二、线粒体基因序列的分析结果表明其转换替代（卜，卜一）中，卜问的替换是卜间替换的倍，颠换替代（，卜一，卜一）中，间的替换是其余种方式的倍，说明拟步甲基因的碱基替代方式存在转换，和颠换卜的偏异。三、拟步甲线粒体和核两种基因序列的碱基构成特点分别是：线粒体基因序列中表现出、偏向性，平均比例为，且第三位点和偏向性更加明显达到，而屺含量为，柑含量明显高于含量。也反映出基因在密码子使用上表现出明显的偏向性。、平均含量分别为，其中的含量最高；基因序列中的平均含量为，略高于卜的平均含量。基因序列的和的含量明显高于其在线粒体中的含量，而和的含量则明显较低。、平均含量分别为，碱基含量相差不大。四、分析了基于和基因序列并构建了分子系统树，与一些学者的研究结果对照，从序列变异上来看，基因序列中变异位点和简约信息位点数及所占总位点比例要比线粒体基因序列低。因此，在拟步甲中，基因的进化速率要远远慢于线粒体基因的进化速率，更适合于较高阶元系统发生关系的研究。五、拟步甲线粒体和核两种基因序列构建的分子系统树的分别为：线粒体基因序列构建的分子系统树中，其下分为个支系，支为所共有，由族的属、族属和族的属、属、属分别聚在不同的线系上；另个支系（）。其中，多毛宽漠甲和突角漠甲聚在一起，：，、，（卜），卜（卜，卜卜，卜），卜硼：厂，厂、，；，黜、，镐，：，（），￥，：，独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得宁夏大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：与学劾时间：知口占年月罗日关于论文使用授权的说明本人完全了解宁夏大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意宁夏大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名：南培屯时间：函谚年厂月多日导师签名：时间：乃卯年月弓日宁夏大学硕：学他论文第一章引言第一章引言昆虫纲是动物界最大的一个纲，长期以来，昆虫分类的研究都是以外部形态为依据，主要以触角、口器、翅脉、生殖器等形态特征作为分类的标准。这些分类依据能在大的分类单位清晰地反映一个物种的分类地位，而在小的分类单位，如属、种内，则很难确定物种的分类地位。从生物遗传的角度看，物种的遗传性状都是由基因决定的，形态特征基因的变异导致了外部形态的差异，而基因的变异是由于分子碱基序列的改交造成的。为此，在生物分类和系统演化的研究中，人们采用了分子生物学技术，以为材料进行研究，解决形态分类上不能解决的问题瞄。分子生物学技术的兴起促使了昆虫分类学的发展，特别是聚合酶链式反应（）技术的普遍应用和各种分子标记技术的出现，使昆虫分类学不但能揭示相似姊妹种之间的差异，还能发现物种的起源和进化规律懵。本项研究利用技术通过对拟步甲科部分种类线粒体基因和核基因序列的研究，探讨选择类群的分类地位和亲缘关系，希望能为拟步甲科的分子系统学研究，进一步完善拟步甲科的分类系统，揭示其系统发育和演化提供分子水平的依据。拟步甲分类研究概述拟步甲科概述拟步甲科隶属昆虫纲鞘翅目多食亚目扁单系、。拟步甲总科是地球上分布范围最广，种类极为丰富，形态分化十分复杂和生活类型极富多样的一类甲虫，这类甲虫从沙漠到海湾；从荒野到居室；从农田到森林草原，其食性之复杂为任何一类甲虫所不及，按其危害特征可分为牧草害虫、农业害虫、森林害虫、仓库害虫、捕食害虫的天敌昆虫、具有形态奇异和色泽绚丽的观赏昆虫等，也是经济意义颇为重要的一类昆虫。此外，一些拟步甲如拟步甲和赤拟谷甲等有很高的食用价值【】。年以来，赤拟粉甲和杂拟粉甲被广泛用于种群力学的研究，并作为遗传学研究的材料，黄拟步甲已多年作为生理学研究的材料。年以来，国外对拟步甲的防御物质（苯醌化合物）研究甚多，已从这类抗生性物质中提取种有机化合物，并在生化和医学上试用【】。通常，拟步甲科的识别特征为：形态变化很大，颜色以暗黑色为主，热带种类则有鲜丽色彩和明显斑纹。体长，触角丝状、包茎状、棍棒状、膝状或将眼完全分割。前胸背板常有纵隆线，少数种类侧区平展。前足基节窝后方开放或关闭。鞘翅侧缘有明显的缘折，通常有条纵线，一般有小盾片线。具后翅或无，翅脉异型，稀有亚肘脉斑纹。跗节以式为主，稀见式或式者。腹部第可见愈合，第可见节可动【。宁夏夫学硕学位论交第辛引言拟步甲分类研究简史拟步甲科由于年建立以来，全球已知个亚科多族多属约种，我国已知亚科族余属近种，约占总种数的。拟步甲科（含总科）的分类系统迄今为止有个（表），在世界各大洲的使用不太一致。表卜拟步甲科分类简史拟步甲科分类研究新进展细胞学研究研究了拟步甲科的染色体认为其基本染色体正常是印；，陀报道了西班牙的种，地中海地区种和加那利岛的种拟步甲染色体，其结论是：雄性减数分裂正常是；染色体排列数目显示至，最多的性染色体系统是，少数为交叉性系统。目前比较一致的结论是：在已研究的拟步甲中，有的显示的正常减数，即个价常染色体加上个端部着丝粒和染色体嗍。腹部防御腺研究。腹部防御腺存在于大多数拟步甲中，位于腹部第节之间，外观为明显或不甚明显的发光膜，解剖研究该膜有一定的分类学价值：腹膜及其侧角连接点上的特征；液囊的位置；第节的构造和防御腺形状州。叶哗等通过研究拟步甲科族属种昆虫防御腺，逐级归纳出属级、族级和科级阶元特征，并利用支序系统学软件初步确定了拟步甲科族的系统发育关系，其结果是花栉甲族是最原始的。触角感觉器宁夏人学硕学位论文第帝引占首次观察了拟步甲中、朽木甲和伪叶甲族种的触角感觉器的超微结构，其结论认为：类群不同其触角结构也不同；感觉器一般稠密的分布于第节上的边缘位置。后翅特征后翅的变化主要表现在三个方面：端膜与翅长的比例。其长度有的，如；有达翅中部的，如；的一些种，等；在前一种情况下，翅脉可分布在翅的中后部，在后一种情况下，翅脉则集中于中部。翅的大小与径室构造拟步甲后翅的径室一般比较大，近于中径横脉，其距离的远和近以及与翅的比例常用于分类；端斑该特征在分类使用较多，主要是斑纹的颜色、分布区域及位置。分子系统学简介分子系统学（）是近年发展起来的一门综合性前沿学利引，用于通过检测生物大分子包含的遗传信息，定量描述、分析这些信息在分类、系统发育和进化上的意义，从而从分子水平上解释生物的多样性、系统发育及进化规律。它是以分子生物学、系统学、遗传学、分类学和进化论为理论基础【】，以分子生物学、生物化学和仪器分析技术的最新发展为研究手段的交叉性很强的学科。研究的主要内容包括群体遗传结构（）、分类学（）、系统发育（）和分子进化（）等方面【】，其研究结果对于保护生物多样性（尤其是遗传多样性），揭示生物进化历程及机理具有十分重要的意义。分子系统学使得系统发育和进化的研究进入分子水平对演化机制的本质进行探讨的阶段，其发展历史根据研究方法的发展大致可分为三个阶段。世纪年代，分子系统学的研究主要在蛋白质的水平上进行。年代以免疫学方法为主，并在脊椎动物亲缘关系的研究上取得了一定成果。年发明了淀粉凝胶电泳技术。年代中期掣应用同功酶电泳证明了动物自然群体中存在着大量的遗传变异，等位酶、同功酶电泳技术开始成为分子系统学的热点技术。年代，分子系统学研究进入了核酸水平时期。年代末期，的限制性片段长度多态性技术开始在脊椎动物和无脊椎动物的种群结构研究中应用，到了年代末期日益成为动物分子系统学研究的有力工具刳。年代以来，以聚合酶链式反应（）和杂交为基础发展了一系列衍生技术，如随机扩增多态性技术、指纹图谱技术和扩增片段长度多态性技术等，近几年来又发展了微卫星指纹图谱技术及核酸序列测定技术，分子系统学在水平的研究飞速发展并取得了大量的显著性成果引。核酸分子系统学技术及其在昆虫系统学中的应用昆虫分子系统学的研究一是根据蛋白质与酶，二是根据核酸。酶电泳是分子水平研究昆虫遗传与进化最经济有效的方法，可以有效的揭示自然居群中遗传结构基因流动、变化系统、选择作用和系统发育等问题。核酸（和）是生物体中最重要的信息分子，也是分子系统学研宁夏人学硕：学位论艾第一章引言究中价值最大、信息含量最多的分子。世纪年代初期，分子生物学革命性变化（重组技术、基因克隆、限制性内切酶的应用、序列分析技术）使得核酸的分子系统学研究成为可能。年代中期产生的聚合酶链反应技术和指纹图谱技术，更是大大地促进了核酸分子系统学的发展鲥。目前，分子生物学技术在昆虫领域的应用主要集中在系统演化及分类鉴定两方面。昆虫系统进化的研究，探索了昆虫属、种间的关系，从分子水平找出其种间特异性差异，从而为昆虫的分类鉴定奠定基础。通过昆虫分类鉴定和系统进化的研究，可以为昆虫的早期鉴定提供必要的研究方法，积累一些研究素材。所以，研究昆虫的早期鉴定，必须了解昆虫的分类及系统进化关系引。昆虫核酸分子系统学的研究最早见于实验动物的果蝇中，主要是用分子生物技术解决果蝇的系统发育和分子进化问题，紧接着在医学昆虫（蚊科）、重要农业昆虫（蚜科、叶甲科、蝗科）的种类鉴定上广泛应用，此外还在分类研究较为深入的蝶类和蜜蜂以及有些目的高级阶元的系统发育关系研究中应用。到目前为止，已在十几个目的昆虫中进行过核酸分子系统学的研究。如：双翅目（朱振华】、蔡继掣、徐书华引，等等）、鞘翅目（刘晓丽【、狳光勇、任洪宝【、黄菲，等等）、直翅目（张宏烈、潘程莹【、马兰【】，等等）、半翅目（齐宝瑛口、冰梅、潘兴丽鲫，等等）等等，在这就不一一列出了。一个良好的分子系统学检测对象应该是含量高、分布广、易于分离和检测的分子适于种内或近缘种的研究，而慢速进化的分子则适宜远缘种类和高级阶元的研究。在昆虫体内，线粒体（）和核糖体基因（）是应用最广的种分子，此外各类和也常应用测。核核分子约由亿亿个碱基对组成，含有万万个基因，在分子系统学研究中可应用的只是其中的少数基因和重复序列，例如：基因、基因、基因、延伸因子基因（）、延伸因子基因（）、多巴脱梭基因（）、同源框基因簇（）和核糖体内录间隔区（）等，以及小卫星、微卫星等重复序列】。核基因序列在昆虫分子系统学中的应用分子系统学是从分子水平上研究生物的多样性及其进化规律的）学科冽。由于序列中含有丰富的生物学信息，记载了生物进化的历史，随着技术的发展和测序技术的成熟，应用序列研究生物的系统发育和进化规律成为当前分子系统学研究的热点。线粒体基因作为一种分子标记，具有分子量小，无间隔序列啪，结构简单，母系遗传，几乎不发生倒位、易位等畸变与重组，含量丰富，易于提取等优点，被广泛地应用于昆虫的系统发育研究幢剐。但线粒体作为一种半自主性的细胞器，其发育受线粒体基因和核基因的双重控制，核基因对线粒体基因的进化有可能造成一定的影响，核基因组中还存在线粒体基因的假基因，从而使线粒体基因用宁夏大学硕：学位论文第一章引寿于系统发育的可靠性和准确性受到影响。线粒体基因是母系遗传招引，其中所含的进化信息并不能完全代表双亲进化的历史，在种群系统学研究中，如果某些物种其种群的性别结构存在性偏异，例如其婚配方式是一雄多雌制，雄性对种群的遗传结构的贡献要比雌性大得多，那么根据线粒体基冈得到的信息可能不能完全反映出种群的遗传结构，甚至得到的是错误的结果。因此线粒体基因树可能只是部分地或有偏异地代表了生物的系统发生，而生物的性状基本上是由核基因决定的，核基因中含有更加丰富的生物学信息，用适当的核基因研究昆虫的系统发育其结果更有可能比较真实地反映出昆虫的进化历史婚。的研究表明核基因与线粒体基因相比的优点是：核基因一般比线粒体基因进化得慢，这使它们成为一种解决分歧久远的比较好的标记；核基因构建的树普遍有比较高的值，与线粒体基因相比更有助于整棵树的解决；核基因的碱基位点速率变异有更高的同质性；核基因的碱基替代速率距阵比线粒体基冈的要均匀。两位学者认为：由于核基因没有线粒体基因的替代偏异特征，昆虫分子系统学应该更加关注核基因数据而不是线粒体基因数据。为了避免线粒体基因和核基因各自的缺点并很好的发挥其优点，不少学者，将核基因序列与线粒体基因相结合研究昆虫的系统发育。当前运用核基因序列或将核基因序列与线粒体基因相结合研究，已是昆虫的系统发育领域的一种发展趋势。核基因是真核生物的染色体上编码核糖体小亚基的基因，由于基因序列及二级结构高度保守，在蛋白质合成中具有重要的功能，一般认为它比较适合于研究高级阶元的系统发育。许多学者已经用序列研究昆虫的分子系统学，例如：国外，等【】将序列数据和形态数据相结合，研究了象甲总科各科之间的系统发育，他们得到的树的拓扑结构很好地解决了各科的单系性和它们之间的关系；等用证明了肉食亚目（）虫水生的几个科，即水生肉食类的单系性；等【主张采取把、和基因作为昆虫分子系统学研究的标记，以增加同源序列之间的可比性；等【在研究竹节虫翅的进化时，用、构建了多新翅类（）虫的分子系统树；等用的区和序列片段，并结合形态数据对全变态昆虫各目之间的关系进行了探讨；和邛测定了种多新翅类昆虫的全序列，并结合数据库中的种其它昆虫的全序列，重建传统的古翅亚部和新翅部昆虫的系统发育，其结果表明直翅目是一单系群；等用研究了半翅目扭蜡蝉亚目昆虫的系统发育。刘晓丽】运用基因作为分子标记，对拟步甲的部分种类进行了分子系统学研究。刘殿钭应用和序列研究蝗总科昆虫的系统进化。本研究选用核】卟基因对部分拟步甲进行序列分析，研究其系统发育，希望能为拟步甲科的分类提供重要的分子证据。宁夏人学硕学位论文第幸弓育线粒体（）每个细胞有数百个线粒体，每个线粒体内含有个线粒体（）分子。是高等动物唯一的核外遗传物质，是约为的双链环状分子。每个分子中任何碱基都可能发生突变，故线粒体突变率很高，约为核的倍以上；且有可能发生在所有组织细胞中，包括体细胞和生殖细胞。它的基因结构、遗传密码和复制具有一些不同于核基因组的特点。其结构紧凑，一环区是唯一的非编码区，为分子的控制区，在的复制和转录过程中起重要作用。已知的重链复制起点和双链的启动子均在一环内，一环的碱基突变率比分子其它区域高倍，作为分子内的高变区，一环分析是多态性研究的重要内容。造成多态性的原因主要是碱基取代、长度变化和序列重排，因而可以用限制性酶切技术直接探查的多态性。线粒体的遗传方式为母系遗传，即母亲将她的遗传给后代，它们再将其遗传给下一代”。这是因为精卵结合时精子提供的只是核，受精卵的细胞质全部来自卵子。的进化率也很高。具有相对分子质量小，严格母性遗传，世代间不发生重组，易于提纯和遗传标记丰富等特点，故被广泛应用于动物起源、分类、系统进化、群体遗传结构和育种等方面的研究卜。通过对多态性的分析，可以了解群体的遗传结构、基因流动及系统发育等方面的情况，并可对杂种优势进行预测。线粒体序列在昆虫系统学中的应用昆虫的线粒体广泛存在于其体内富含线粒体的飞行肌中和卵内，昆虫的大小一般为，以高拷贝数目存在于线粒体内川。相对于核来说，昆虫的是一个封闭的环状双链，核酸序列和组成比较保守，以它作为模板制作的反应引物的通用性比较强。对进化过程中不同生物体的序列的核苷酸替换率的比较研究发现，基因组的替换率比核高倍。基因组中不含问隔区和内含子，无重复序列和不等交换，在遗传过程中不发生基因重组、倒位、易位等突变，并且遵守严格的母系遗传方式引。正是由于以上结构和进化上的特点，已成为研究生物（主要是动物）进化的重要材料满一柏。已有很多学者利用上的不同基因对昆虫纲内不同分类阶元之间的系统发育关系进行了研究。多数动物的线粒体由个基因和一段长度可变的非编码序列组成。这个基因分别是：个核糖体（和）、个转运（）、个蛋白质基因（、，合成酶亚基和、脱氢酶）和个非编码区（环）。可用系统发育分析的基因有、和等，其中、和是应用频率最多的一组分子标记，而应用的频率又为最高，几乎在昆虫纲的所有目中都获得了它的同源序歹（）。因此，对不同昆虫类群进行分子系统发育分析时，应选择不同的基因或片蝌】。宁夏人学硕学位论丈第一章引言线粒体细胞色素氧化酶亚基（，）细胞色素氧化酶在呼吸链电子传递和质子的跨膜反应中发挥着巨大作用，在真核生物中它由多个亚基组成，其中咂基、和由线粒体编码，其余为核基冈编码。这些亚基多为跨膜蛋白，跨过线粒体的内膜，亚基和组成酶的催化核心。细胞色素氧化酶亚基（，）是线粒体上三种细胞色素氧化酶亚基中最大的一种编码蛋白基因，果蝇科的基因编码个氨基酸，编码个，编码个；等曾对它在系统发育研究中的进化模式和保守引物的设计做过详细的分析。基因较基因有许多优点：相对保守性同时有足够的变异，序列长度合适且可以通过通用引物来扩增，符合基因序列的长度和进化速率。由于氨基酸密码的简并性，许多第位置和一些第位置的碱基受到的限制较小，在这些位置发生的替代（置换）被称为沉默的（），它们的改变并不影响所编码的氨基酸。因此，这些较少受剑限制的密码子位点的进化速率比较高，这也决定了它比较适合对亲缘关系较近的分类阶元进行系统发育的研究。目前，国内外主要是将线粒体基因组基因用于分子系统学及种群遗传分析研究。国外，如等毛删利用线粒体基因分别研究了拟步甲和两属的系统学问题。等”对凤蝶属的研究中发现，和的序列数据很好地支持了亚属及种团内的系统发育关系，但无法解决较高分类水平的系统关系。等基于与基因部分序列对金龟甲亚科种不同族的粪金龟进行了系统发育分析，分子数据支持了亚科内大多数已知族的组成及其合理性，通过对其筑巢行为进化趋势的探讨，发现挖洞和翻滚的行为都是单起源的。在此基础上等把基因序列的一个约的片段作为标准基因区域，称为条形码，可以用来帮助解决有关种的鉴定问题。等刚对鞘翅目的系统发育研究；等啪对金龟子总科丽金龟子亚科的分类；等哺对双翅目粪蝇科的系统发育；等哺对灰蝶科￥属的系统发育分析；等旧对意大利蜜蜂括遗传变异研究；等嘲对马蜂亚科的系统发育分析；等嘲对弹尾目属的系统发育研究。随着研究的深入，昆虫分子系统学已经与昆虫学的其他应用学科紧密结合起来，如法医昆虫学、生物防治等。等扩增了人尸体上几种丽蝇幼虫线粒体和基因的特定片段，采用不同限制性酶切片段来鉴别丽蝇幼虫，为丽蝇种类的快速鉴定及人体死亡时间的估计提供了帮助。国内，如：罗晨、姚远等】利用基因片段标记，采用序列分析的方法，从分子生态角度研究近年来我国暴发危害的烟粉虱（）个种群的生物型，结果表明我国烟粉虱实验种群的生物型与型和型种群为同一生物型。诸立新、吴孝兵、晏鹏【】对中国产种尾风蝶属蝴蝶的细胞色素氧化酶（）基因的部分序列进行了分析。构建了分子系统树，结果表明尾凤蝶属一尾种组与多尾风蝶亲缘关系较近，而三尾风蝶较早分化出来。同时结果表明丽斑尾风蝶和二尾凤蝶的基因没有序列差异。张民照啼对中国飞蝗各亚种线粒体的基因片段进行了扩增并测序。结果表明，扩增产物为单一带，大小约为。对此扩增产物序列分析证明所扩增的基因序列是一个含宁夏夫学硕：学论文第一章引言混不清的序列，说明在中国飞蝗不同种的基冈组中存在线粒体的假基冈序列，因此以飞蝗基因组为模板扩增出的基因片段不适宦用作分析飞蝗种群遗传和系统发育的分子标记。线粒体基因和核基冈在昆虫分子系统学中的应用，可以明确阶元之间的进化关系，确立一些有争议物种的分类地位以及进行相关物种的系统地理探讨。运用线粒体基因序列与核基因序列相结合来研究昆虫的系统发育是分子系统学领域的一种必然发展趋势，它可以为我们解决昆虫分类问题提供分子上的证据。本文分别用基因序列和核序列探讨拟步甲科低级阶元的系统发育，探讨选择类群的分类地位和亲缘关系，为丰富拟步甲科的分子系统学研究，进一步完善拟步甲科的分类系统，揭示其系统发育和演化提供分子水平的依据。昆虫系统学研究的主要方法目前用于昆虫系统学研究的主要方法有：核酸序列分析（宅）、限制性片段长度多态性分析（，）、分子杂交技术（）、随机扩增多态性分析（，）、指纹图谱技术、单链构象多态性（，）和双链构象多态性（，）分析等。序列分析（）般用来检测靶分子（和的任何片段）序列上所有位点的变异，应用于分子进化和系统发育研究中。序列分析是进行分子进化及系统发育研究最有效、最可靠的方法，已得到广泛应用引。随着生物技术的不断提高，药品、试剂盒及酶制剂越来越廉价，此方法得到了广泛的应用。现有的序列分析研究结果表明，每个基冈均有其自身特有的平均进化速率，可用于不同水平的系统发育研究；不同基因间的进化速率不同，同一基因不同区段的核苷酸的保守程度也不一样，这种保守性与编码蛋白质或的二级结构有关。快速进化的基因或核苷酸区段（如，的区域）适合于种内或近缘种的系统发育分析；慢速进化的基因（如及其产物）适合于远缘种类或高级阶元的系统发育分析。本研究选用序列分析法，探讨拟步甲科不同族之间、不同属、种之间以及同种不同个体之间的分子的差异，研究选择类群的分类地位和亲缘关系。序列的突变所有形态与生理性状最终都是携带的遗传信息所控制的，那么这些性状的突变就是分子中的某些变化的结果。变化有种基本类型：一个核苷酸被另一个不同的核苷酸替代（），核苷酸缺失（）、核苷酸插入（）和核苷酸到位（）。插入、缺失和到位的出现是以一个碱基为单元。如果插入或缺失出现在蛋白质编码区，他们可能改变核苷酸序列的阅读框。核苷酸的替代分为两类：转换（）和颠换（）。转换指的是一个嘌呤（）被另一个不同的嘌呤所替代，或一个嘧啶被另一个嘧啶替代。其他的核苷酸替代皆为颠换。宁夏人学硕：学位论文第一章引言氨基酸序列的进化演化在年快速测序方法发明前，大多数分子进化研究基于氨基酸序列数据。如今，测序比氨基酸测序简便的多，而且可以利用遗传密码从序列推导出氨基酸序列，直到今天，氨基酸序列进化的研究依然是有用的。研究进化距离对物种进化是非常重要的，它也可以用来构建系统树并估计分歧时间。在氨基酸序列数据方面，通常以氨基酸替代数来测定距离，但在不同假设下，存在着不同的测度（针对编码序列而言）。系统树的构建方法用统计方法重建系统发育树分别独立地起始于形态学性状的数值分类法和分析基因频率数据的群体遗传学。目前，己有许多统计学方法可以用于分析分子据来重建系统发育树。常用的有三类：距离矩阵法、简约法和似然法。距离矩阵方法距离矩阵方法（）是指以距离系数矩阵为基础的各种系统发育分析方法。这类方法首先要求原始数据以成对分类单元之间的距离形式表示，对于性状数据编码后要换成距离数据。当距离关系满足超度量特性时，可以直接应用聚类分析方法构建超度量树，否则就要用叠加树法。这类方法的优点为：算法较性状数据分析方法简单直观；因对进化过程没有其它更多的假设，故系统分析的结果具有稳定性。缺点为需将原始数据转变成距离数据，数据转换的过程中不可避免的引起某些信息的丢失：为使距离符合叠加条件，需要对远缘种类之间的距离数据进行校正，需要进化过程和进化特征方面的知识；因算法与本身及其运算结果的统计学分析较难，目前还未建立起系统树上分类单元之间的期望距离分布的概率模型。目前，应用较多的是叠加树法。其中最常用的为法和法。法（曲，邻接法）：该方法对距离的校正比较关键，在成聚过程中连接的是分类单元之间的结点而不是分类单元本身。法中原始距离数据用于估算系统树上所有端结分类单元之间的距离矩阵，校正后的距离用于确定结点间的连接顺序。其技术过程十分简单，算法中既包括了不同分枝形式树的比较，也给出了分枝长度的值。施法（，最小进化法）：由和（）提出，后来由和（）对算法进行了简化。该法不受平行和回复突变的影响，如果距离数据满足叠加性条件，一般能给出正确的树。简约性方法简约性方法（）是基于简约性标准推论系统发育的支序分析方法。它包括许多相关的方法，所有简约性方法的分析步骤都相同，但是这些方法对性状进化的假设各不相同。该方法具有以下几个方面的优点是它直接应用原始性状数据，并不需要将原始数据转换成距离数据，避免了不可逆转的信息丢失；简约性方法与其它性状分析方法相比，较少依靠关于序列进化宁夏大学硕：学位论文第一章引言的假说，或至少能依靠一种更符合实际的简单的进化假设；人多数简约法的计算机算法及程序比其它方法更成熟。但是该方法的缺陷是只适用于亲缘关系密切的种类或序列之间的分析，对于进化时间较长的物种或序列，由于平行和同复突变的干扰，会得出不正确的结果。当系统树上不同支序在进化改变量上不等时也会引起误差。简约性方法中最常用的为法。法（，最简约法）：是简约性性状数据分析中最简单的分析法之一，对允许的性状状态转换作很少的限制，允许性状状态之间的可逆性转换。形成最简约树的两个最主要的题是根据选定的性状进化模型计算所有分枝形式树上性状状态改变的最小数及发现具有最小性状改变数的所有分枝形式的树。该方法对性状进化的假设少，所形成的树一般都具有最小的进化改变（树长最短）。极似然法极似然法（，法）是应用统