应用SELDI-TOF-MS技术筛选早发型重度子痫前期血清生物标志物及建立诊断模型的实验研究.doc

福建医科大学硕士学位论文应用SELDI-TOF-MS技术筛选早发型重度子痫前期血清生物标志物及建立诊断模型的实验研究姓名：刘慧英申请学位级别：硕士专业：妇产科学指导教师：何晓宇20100301福建医科大学届硕士研究生学位论文个差异峰构成。此模型对所有标本的筛查灵敏度为，特异度为。结论：早发型组与常组的血清差异蛋白有可能作为早发型重度子痫前期发生发展及诊断的特异指标。早发型组与晚发型组的血清差异蛋白的存在表明早发型重度子痫前期与晚发型重度子痫期可能存在不同病因。为、的差异蛋白可能为早发型重度子痫前期的特异血清标志物。初步鉴定结果提示早发型重度子痫前期可能与，板功能、炎性反应、钙代谢有关。本实验建立的分类决策树模型对早发型重度子痫前期的诊断有一定意义。关键词：表面加强激光解析电离飞行时间质谱早发型重度子痫前期特异性标志物福建医科大学届硕士研究生学位论文：，：（：）：、，、福建医科大学届硕士研究生学位论文、，、：；，；、：、，：；福建医科大学届硕士研究生学位论文缩写英文缩略词表英文全称妣中文全称表面加强激光解吸电离飞行时间质谱技术受试者工作特征曲线（一）能量吸收分子质荷比肉桂酸芥子酸坏乙胺丙磺酸二硫代苏糖醇弱阳离子蛋白芯片金属鳌合离子蛋白芯片（）生物标志物模型软件蛋白质质谱分类决策树三氟乙酸灵敏度特异度受试者工作特征曲线分子量信号噪音比质量控制早晚发型重度子痫前期福建医科大学届硕士研究生学位论文学位论文原创性声明和版权使用授权书学位论文原创性声明本人郑重声明：所生交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究：作所取得的真实成果。除文中已注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作晶成果。对本论文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名（手写）：臃瓢盟红学位论文版权使用授权书睫本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构（如国家图书馆、中国学术期刊电子杂志社的中国优秀博硕士学位论文数据库、中国科学技术信息研究所的中国学位论文全文数据库等）送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权福建医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）作者签名（手写）：垃年乒月上日导师签名（手写）：加口年上月日福建医科大学届硕士研究生学位论文应用技术筛选早发型重度子痫前期血清生物标志物及建立诊断模型的实验研究刖舀子痫前期（）是妊娠期特有疾病，是妊娠高血压疾病的最常见类型，起病于孕周前的重度子痫前期称为早发型重度子痫前期（，），在孕周以后发病的重度子痫前期称为晚发型重度子痫前期（，）。早发型重度子痫前期是比较棘手的产科重症，其发病早，病情重，母儿愈后差，严重威胁孕产妇和胎儿安危。目前早发型重度子痫前期的定义国内外尚无统一标准。我国学者杨孜【】认为：临床以孕周界定早发型重度子痫前期更能准确反映发病孕周与围产结局的关系。但多数学者【】仍以孕周作为分型界限。早发型重度子痫前期的临床特点是：病情重；更易出现各种严重的合并症，母亲常合并各器官损害和胎儿生长受限（）、新生儿病率高等；发病和终止孕周越早，围产儿结局越差；母亲各靶器官损害存在不平行性，以胎盘损害最常见。下次妊娠的再发风险高，而且其子女患子痫前期的风险增高。近年来越来越多的研究【“】显示早发型重度子痫前期在发病机制的多个环节与晚发型不同，提示可能与晚发型存在不同的病因及发病机制。目的研究发现早发型重度子病前期可能的发病机制包括：遗传性，包括易感性基因及其突变。许多研究认为早发型重度子痫前期与是否为初产妇无关，提示早发型重度子痫前期发生具遗传因素作用。发生早发型重度子痫前期的孕妇，可能自身存在子痫前期发生的易感因素。胎盘源性细胞因子表达异常【】。滋养细胞具有内皮、免疫、神经、激素等多种细胞功能，产生多种血管活性物质，合成多种细胞因子，滋养细胞的生物学功能也受细胞因子的影响，其中很多因子与早发型重度子痫前期的发生有密切的关系。如血管生长因子、胎盘生长因子不足。免疫平衡和免疫耐受失调。免疫耐受异常与早发型重度子痫期母胎免疫耐受机制的破坏导致母体对胎儿的免疫反应被认为是早发型重度子痫前期发病机制的关键。人主要功能是诱导细胞凋亡，高度表达的可造成对的封闭，使正常的免疫下调机制失效，间接反映了组织系统不同性质的损伤。子宫一胎盘部位的细胞借助系统对胎儿起保护作用。】等福建医科大学届硕士研究生学位论文研究表明：大量存在于正常妊娠晚期胎盘，而早发型重度子痫前期患者胎盘绒毛滋养细胞表达明显减少，类似于一些特殊的免疫豁免部位。早发型重度子痫前期患者胎盘绒毛滋养细胞表达明显减少，系统对胎儿起保护作用减弱，免疫机制失效导致早发型重度子痫前期的发生。系统性炎性反应。是人类蜕膜组织中的巨核细胞受到细菌的刺激后产生的一种细胞活素。研究发现在胎盘床有巨噬细胞过度聚集能够限制绒毛外滋养细胞对螺旋动脉的侵入（通过的分泌和色氨酸缺乏共同对凋亡的调节），可能是早发型重度子痫前期发病的重要发病机制。另外，一、也可能参与了早发型重度子痫前期的发病过程。本研究以早发型重度子痫前期患者为研究对象，与相应孕周的常孕妇以及晚发型重度子痫前期患者相比较，运用技术筛选早发型重度子痫前期患者血清特异生物标志蛋白，探讨引起早发型重度子痫前期发生的可能因素，为研究早发型重度子痫前期的发病机制和诊断提供依据，为阐明其可能与晚发型重度子痫前期存在不同的发病机制提供蛋白质分子学基础。以人类基因组计划完成为标志的后基因组时代的到来，使生物功能的执行者一蛋白质的研究成为新世纪生命科学研究的主要对象与核心。蛋白质组学（）是对组织或细胞中的全部蛋白质组成的种类及量进行分析的新兴学科【】。它以细胞内所有蛋白质及其动态变化规律为研究对象，能提供更多的生命信息，可在更深入、更贴近生命本质层次去发现和理解生命活动规律以及重要生理、病理学的本质，丌辟了生命科学研究进入后基因组时代的新天地，也为医学研究提供了全新的技术手段和思维模式。蛋白质组研究最常用的质谱技术为表面激光解析电离飞行时间质谱（），它是在基础上改良的，是继基因芯片之后的新一代生物芯片技术。技术直接从蛋白质着手来探讨疾病发生过程中蛋白质种类及数量的变化，使人们对大批量的临床标本，如血清、尿液、脑脊液、组织裂解液等，进行高效的蛋白质组分析，使寻求用于临床诊断的特异敏感的生物学标志物成为可能【。在阐明疾病的分子生物学机制、发现新的疾病标志分子、研究治疗药物新靶点和药物毒理学方面都有广泛的应用。血清蛋白质组的研究能获得大量的、完整的和动态的血清蛋白质谱。而每种福建医科大学届硕士研究生学位论文疾病在症状出现之前及不同的发展阶段，都有其独特的蛋白质变化，分析这些蛋白质的变化，有望获得用于临床诊断的生物学标志物。生物学标志物是一类能反映疾病或治疗干预所致的生理状态变化的生物指示分子。理想的生物标志物应具有特异、敏感、有预见性、在临床前和临床阶段问起桥梁作用、可经创伤性操作测定等特点。由于血液中的蛋白质容易反复获得，因此，利用血清进行蛋白质分析以获得生物标志物是较好的选择。本实验采用技术绘制早发型重度子痫前期患者，与早发型相应孕周的正常孕妇以及晚发型重度子痫前期患者血清蛋白质谱图，通过比较分析筛选早发型重度子痫前期的血清特异性蛋白质标志物，探讨子痫前期的发病机制和寻找该病的特异性标志物，同时也为阐明早发型重度子痫前期与晚发型重度子痫前期存在不同的发病机制提供客观依据。利用建立早发型重度子痫前期的蛋白质分类决策树模型，应用此模型对所有患者血清进行检测分析，进一步验证该模型的临床应用价值，最后将差异蛋白质进行蛋白质数据库搜索以初步鉴定差异蛋白。福建医科大学届硕士研究生学位论文材料与方法材料研究对象选择年月至年月南京军区福州总医院妇产科的重度子痫前期患者及常孕妇总计例进行分组：早发型组：例早发型重度子痫前期患者；晚发型组：例晚发型重度子痫前期患者；正常组：例与早发型相应孕周正常孕妇，此组孕妇妊娠期及分娩后均确认为下常。以乐杰主编的妇产科学（人民卫生出版社，第版）为诊断标准。研究对象均排除影响血清蛋白质含量的其他相关疾病如：妊娠合并慢性高血压、妊娠合并慢性肾炎、妊娠合并癫痫、妊娠合并脑炎、脑肿瘤、脑血管畸形破裂出血、低血糖昏迷、糖尿病高渗性昏迷等。仪器与试剂主要仪器（）一孔芯片处理器孔芯片处理器高速低温台式离心机一低速冷冻离心机一纯水系统一电子分析天平微量加样器精密计振荡器（）一一美国公司一美国公司美国公司一珠海黑马医学仪器有限公司科大创新股份有限公司荣健（香港）国际科技有限公司一美国公司，上海雷磁公司一广州仪科实验技术有限公司冰箱海尔公司冰箱一型超声波清洗器生化仪主要试剂氯化钠海尔公司昆山市超声仪器有限公司同本公司上海化学试剂公司三羟甲基氨基甲烷一上海化学试剂公司福建医科大学届硕士研究生学位论文磷酸氢二钠一磷酸二氢钠上海化学试剂公司上海化学试剂公司氢氧化钠上海化学试剂公司醋酸一盐酸一醋酸钠一才二硫代苏糖醇（）一三氟乙酸（）尿素一上海化学试剂公司一美国公司一一美国公司一美国公司美国公司美国公司美国公司一美国公司环乙胺一一丙磺酸（）一一美国公司乙腈一（）美国公司美国公司一蛋白质芯片一蛋白质芯片主要溶液配置美国公司美国公司美国公司的配置（，！，）（）称取（，终浓度为），加入和充分溶解（注意：加温不能超过（，如果难溶，添加少量）；（）在上述溶液中加入充分溶解。再用定容至调至，加入，定容至：分装：分装入离心管，用封口膜封口，放入保存（防反复冻融）。的配置（，）（）称无水（，最终浓度为），溶入中：（）用调至；用定容至，保存。福建医科大学届硕士研究生学位论文的配置（，！）（）称取（最终浓度为，），溶入溶液，加入（终浓度），充分溶解，用氢氧化钠，调至，用溶液定容至，保存，作为结合缓冲液；（）称取（最终浓度为，），溶入溶液，充分溶解，用氢氧化钠，调至，用溶液定容至，保存，作为清洗缓冲液。溶液的配置一（）（）（）溶入；（）用定容至，保存。芯片准备饱和溶液配制（）（）溶液：取，加入中，混匀，封口，避光，保存，使用周期不超过天：（）分装：取，分装为每管，用锡纸包严，保存，使用期不超过周；（）溶液配制：使用溶液前，取溶液和，同时加入分装管中，在涡旋混合器上充分混合（约）静置，以，离心，取上清后备用。建议每天新鲜配制。本研究所需要各种软件及诊断评价指标蛋白质质谱数据的相关软件（）标本数据库的建立：（美国）。（）资料统计分析：（美国）。（）蛋白质谱数据收集软件：（美国）。（）蛋白质谱数据分析软件：（美国）。诊断评价指标（）灵敏度：实际患病且被诊断为阳性的概率就是灵敏度（，），福建医科大学届硕士研究生学位论文也称为真阳性率（，）该指标只与病例组有关，反映了诊断试验检出病例的能力。即：（）】（）特异度：实际未患病且被诊断为阴性的概率就是特异度（，），也称真阴性率（，），该指标只与对照组有关，反映了诊断试验排除非病例的能力。即：【（）】（）曲线全称为受试者工作特征（）或相对工作特征（）曲线，该方法目前广泛应用于医学诊断试验性能的评价。曲线下面积（，）可反映诊断试验的准确性大小，这一指标取值范围在之间。完全无价值的诊断，完全理想的诊断，为时，表示诊断准确性较低，为时，表示诊断准确性中等，以上是表示具有较高的准确性。芯片的选择预实验中比较和在本实验标本中的效果，发现得出的峰数较多，最终选择（金属鳌合离子蛋白芯片）作为正式实验蛋白芯片。方法标本的收集所有试验对象均在入院次晨无菌采静脉血，冰盒运输（）。血液在冷冻离心机下，离心，用个管分装，内放入冰箱保存，实验检测血清均仅一次冻融。（注：采血时间门诊患者于清晨空腹，入院即急诊手术者则于术前）操作规程（金属鳌合离子芯片）小心取出芯片，在芯片背后标记时间，芯片种类，操作者的姓名等资料（注意：不要触及芯片表面）。将芯片装入生物芯片处理器（），在组装生物芯片处理器时，注意不要触碰加样孔，同时要将：签片上带有“”的一头放在外端，注意密封。福建医科大学届硕士研究生学位论文每孔加入的溶液，转分震荡，甩掉溶液，重复次，而后每孑，入水，立刻甩出转分震荡，甩掉水。每孔加入缓冲液（，），置振荡器（）转分震荡，甩掉缓冲液，而后每孔加入水，立刻甩出转分震荡，甩掉水。每孔加上结合缓冲液（。，）。置振荡器（）转分。甩掉缓冲液。重复上述操作一次。上样，在芯片处理器每孔中加入处理好的样品（缓冲液与血清比例为：），置振荡器（）转分，。震荡小时。每孔加入的结合缓冲液（，），室温置振荡器（）转分震荡，甩去孔中液体（注意不要甩得太干），再次加入结合缓冲液，重复操作两次。立刻拆开芯片处理器，取出芯片后，室温干燥，在每个加样孔上加，待干（后）。即可上机测定。芯片检测、数据采集和参数设置建立一个新数据；建立一个新项目；使用标准蛋白质芯片校正，校正质谱仪的分子量；在选择当前芯片对话框中，添入有关信息；在（）对话框中，设，根据仪器的状态，提高，这样，的蛋白质可被偏转；建立两个点阅读程序；（低能量激光强度）：设最高分子量为，最佳分辨率范围从到选择最佳激光强度福建医科大学届硕士研究生学位沦文选择最佳检测灵敏度聚焦到最佳中心设数据收集方法为设数据收集参数：；：设预热位置用个，选择激光强度为最佳激光强度，括预热点。数据收集不包（高能量激光强度）设最高分子量为，最佳分辨率范围从到选择最佳激光强度选择最佳检测灵敏度聚焦到最佳中心设数据收集方法为设数据收集参数：、：、：、：。设预热位置用个，选择激光强度为最佳激光强度，数据收集不包括预热点。仪器校正（外标和内标校正）一时问飞行质谱仪每天用标准多肽和低于的蛋白质标准分子校正（外标校正），要求系统的质量偏差小于。本研究采用标准蛋白多肽芯片进行仪器外标校下，该标准蛋白多肽包括（）、（）、（）、【（）、（）。对获得的原始数据按以下步骤进行校正（内标校）：首先将所有质谱按照总离子流校正到同一水平；选取第一条质谱图中和左右的蛋白峰，并将其校正为其实际分子量和；用的方法将所有质谱图中的矛左右的蛋白峰都校正到其实际分子量和。按照上述方法校正后，质谱图每个蛋白峰的质荷比误差会降到以下，从而得到精确的蛋白指纹图，且最大限度福建医科大学届硕士研究生学位论文地将实验芯片间误差降低到最低水平，以保障后续实验分析的可靠性。数据处理与统计原始信号和数据先用做校下，使总离子强度及分子量均一化。对优化范围的蛋白质质谱图在支持下过滤噪音，第一次噪音过滤值为，允许分子量偏差为，以为最小阈值聚类（在总样本中要出现的比率大于），然后再作第二次的噪音过滤，过滤值为，来增加较小丰度的峰值。过滤后得到的初步筛选结果输出到表中，对初步筛选出来的同一的蛋白质质谱峰相对强度平均值做组问比较检验，按照值的大小确定在不同组别样本中上调或下调的不同质荷比的蛋白质，筛选出具有潜在分类意义的蛋白质峰，找出每一个相关的蛋白质在不同样本中的表达差异。生物信息学处理蛋白质质谱峰强度值资料经软件处理后，结果输入表格中，再经软件阅读分析，样本被分为训练集和测试集，训练集数据被用来生成最大的决策树，一旦这种最大决策树形成后，再经修剪等过程相继生成一系列源于它的小的决策树，决策树依据质谱峰强度的不同将样本分到不同的节点。首先根据一个质谱峰强度将总样本（母节点）分到两个节点内（子节点），而后每一个子节点又自动转换成为母节点又会根据一个新的质谱峰的强度值再分类，当一个样本中的质谱峰强度小于或等于这个选定的阈值时，就被分到左边的节点内，否则分到右侧，直到所有输入的样本都被分到终节点为止，被选作分类变量的蛋白质必须是分类时错误率最低。而测试集样本被用来估计各决策树样本分类错误率的大小，最好的决策树分类模型是那种测试集分类错误率最低或接近最低但相对较小的决策树。按照软件要求，当处理的样本数足够大（一般大于）时，该软件推荐选用独立于训练集的样本作测试集对训练集形成的决策树进行验证，但小样本量研究推荐使用交叉验证的方法得到决策树测试结果。用倍交叉验证。首先用所有样本资料进行训练并形成最大决策树及修剪后得到的不同大小决策树，随后把这些训练样本随机分为大致相等的个部分，每个部分包福建医科大学届硕士研究生学位论文含依据变量分配的相似资料，选择其中前个部分的资料作为训练集再次进行训练并尽可能生成最大决策树，使用第个部分的样本资料作为测试集用于测试源于该决策树的各个决策树的分类错误率，并建立分类模型；再用另外个部分作为训练集进行训练尽可能形成最大决策树，采用另外十分之一部分的样本资料作为测试集测试源于这一决策树的各决策树的分类错误率：相同的过程重复持续进行，直至所有个部分都被作为测试集样本完成测试为止，这个小测试组的测试结果被整合在一起形成针对各个决策树的分类错误率，这些分类错误率即相当于基于全部训练集样本形成的决策树的测试集分类错误率，因此能够测试到各决策树对全新样本的预测能力的好坏，从中找出最佳决策树分类模型，得到区分三组样本能力最强的蛋白质组合及对训练集和测试集样本分类的灵敏度（病变样本诊断率）和特异度（对照样本排除率）等【。差异性蛋白峰和分类决策树诊断价值的验证运用软件分析全部例血清样本（训练组例测试组例）的蛋白质质谱数据，验证分类决策树诊断模型的敏感度和特异度，进行方法学评价。蛋白质鉴定的查阅我们利用的在线分析软件（）在和数据库中查找这个早发型重度子痫前期的特异差异蛋白可能对应的蛋白质肽。输入分子量以获得蛋白质的名称，查找参数如一下：（）福建医科大学届硕士研究生学位论文结果临床资料分析分析本研究中的例重度子痫前期患者的临床资料，按重度子痫前期发病孕周分为周的早发型组例，周的晚发型组例。比较两组孕妇基本情况、临床检验及新生儿出生时情况发现早发型组发病孕周、终止妊娠孕周、保守治疗时间、总住院天数、小时蛋白尿、新生儿出生体重、阿氏评分与晚发型组比较均有统计学意义，而发病年龄、收缩压、舒张压、尿酸、肌酐、一二聚体、血小板计数、一反应蛋白、分娩前单核细胞趋化因子一、分娩后单核细胞趋化因子一两组比较均无统计学差异（见表）。表早发型组与晚发型组临床资料比较早发型组晚发型组值年龄发病孕周住院天数收缩压舒张压尿蛋白尿酸肌酐血小板计数分娩孕周治疗天数出生体重阿氏评分分娩士士士。士士士士士士士士士士士士士士士。坌丝蜃丛曼巳二！墨：