洋葱开花相关基因AcLFY的克隆与表达分析

园 艺 学 报 2013，40（2） ：283291 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：收稿日期：20121122；修回日期：修回日期：20130109 基金项目：基金项目：公益性行业（农业）科研专项经费项目（200903018） ；黑龙江省高校重点实验室开放基金项目（GS2009004） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：acaciawy ，Tel 洋葱开花相关基因 AcLFY 的克隆与表达分析 叶阳阳，陈 典，王 勇* （东北农业大学园艺学院，农业部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，哈尔滨 150030） 摘 要：摘 要：以洋葱（Allium cepa L.）品系1007为试材，采用同源基因克隆及 RACE-PCR 的方法， 获得植物开花调控关键基因 LEAFY 的同源基因的 cDNA 序列，命名为 AcLFY，GenBank 登录号为 JX275962。序列分析表明，该基因包含 1 个 1 119 bp 的开放阅读框，编码 372 个氨基酸，该氨基酸序列 含有 5-N 端脯氨酸富集区，亮氨酸拉链结构和中央酸性区，具有 LEAFY（FLO）家族的典型结构特征。 同源分析表明，该氨基酸序列与水仙的同源性接近 70%，与其他高等植物 LEAFY 类蛋白的同源性均在 50%以上。进化树分析表明 AcLFY 与单子叶植物的亲缘关系高于双子叶植物。荧光定量结果显示，AcLFY 在洋葱抽薹开花的整个过程中都有表达，在抽薹初期的花序分生组织中表达量最高，在花器官中只有微 量表达，花器官形成后，主要在叶片中表达。 关键词：关键词：洋葱；AcLFY；抽薹开花；基因克隆；表达分析 中图分类号：中图分类号：S 633.2 文献标识码：文献标识码：A 文章编号：文章编号：0513-353X（2013）02-0283-09 Cloning and Expression Analysis of Flowering Related Gene AcLFY from Allium cepa YE Yang-yang，CHEN Dian，and WANG Yong* （Department of Horticulture，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops，Northeast Region，Ministry of Agriculture，The Northeast Agriculture University，Harbin 150030，China） Abstract：The LEAFY gene plays a key role in the regulation network of plant flower development， and its homologous gene named AcLFY（GenBank accession No.：JX275962）was isolated from onion （Allium cepa L.1007 ）using homology gene cloning and RACE-PCR. Sequence analysis showed that the AcLFY gene has a 1 119 bp open reading frame（ORF）encoding 372 amino acids. The amino acid sequence contains a 5-N praline-rich region， a leucine zipper and a central acidic region， which are typical structure features of LEAFY（FLO）family. Homology analysis showed that the deduced AcLFY protein is highly homologous to other LEAFY proteins from different species，especially to the one from Narcissus tazetta with approximately 70% identity. Phylogenetic tree analysis indicated that AcLFY is more related to LEAFY in monocotyledons than those in dicotyledonous plants. The real-time PCR results showed that the AcLFY was detected during the whole period of bolting and flowering in onion，and it had a high transcription level in inflorescence meristem at the beginning of the bolting but nearly no transcription in floral organ. After the development of floral organ，the AcLFY gene mainly expressed in leaves. 284 园 艺 学 报 40 卷 Key words：Allium cepa；AcLFY；bolting and flowering；gene cloning；expression analysis 洋葱（Allium cepa L.）生产中的抽薹问题会严重影响产量与品质，研究抽薹相关机理对于人为 调控洋葱的抽薹开花具有重要意义。 抽薹开花是植物接受光、温等环境因子的诱导，经过一系列信号转导，启动成花决定过程中的 控制基因， 并在诸多基因的协同作用下引起花芽分化， 导致花器官发生的过程 （Christian & Andreas， 2009） 。 在诸多基因中， 花序分生组织特异基因 LEAFY 是关键基因， 它决定着植物发育的方向 （David et al.，2012） 。LEAFY 最早被发现于拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，它特异表达于花序分生组织， 通过激活下游基因 AP1 的表达来启动花的分化（Weigel et al.，1992；Sarah et al.，1999） ，并且能够 在花分生组织形成后继续促进花器官特征决定基因 AP3、PI、AG、SEP2 以及 SEP3 的表达（Weigel & Meyerowitz，1993；William et al.，2004）。转拟南芥 LEAFY 基因的烟草（Ahean et al.，2001） 、 杨树（Leandro et al.，2001）等植株均呈现明显的早花现象，表明 LEAFY 在花序和花发育过程中扮 演重要的角色，它不仅参与花的发育，而且控制花序分生组织向花分生组织的转变和开花时间，是 一个开花“开关”（Ng & Yanofsky，2000） 。 单子叶植物和双子叶植物的 LEAFY 基因虽然在序列上具有较高的同源性， 但在表达特性上并不 完全一致（吕玲玲 等，2011） 。本研究旨在分离洋葱 LEAFY 同源基因，并对其时空表达进行相关研 究，以期为洋葱的抽薹调控奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 供试材料为洋葱品系1007 ，由东北农业大学葱蒜课题组提供。该洋葱品系为长日型自交 4 代的黄皮洋葱，性状优良，稳定性好。 2011 年 11 月将该品系鳞茎定植于东北农业大学园艺试验站 2 号加温温室，至 2012 年 6 月抽薹 开花，期间取材。根据已克隆的拟南芥、风信子、水仙和水稻等植物的 LEAFY 同源基因的表达时期 和部位，选取洋葱抽薹初期的花序分生组织 cDNA 作为 RT-PCR 和 RACE 模板。 试剂为 Trizol （Invitrogen） 、 M-MLV Reverse Transcriptase （MBI） 、 限制性内切酶 （MBI） 、 LA Taq DNA Polymerase（TaKaRa 公司） 、3-Full RACE Core Set Ver.2.0（TaKaRa 公司） 、5-Full RACE Kit （TaKaRa 公司） 、SYBR Premix Ex Taq （TaKaRa 公司） 、pEASY-T3 Cloning Kit（TransGen 公 司）等，以及各种常规试剂。 1.2 AcLFY 基因的克隆和序列分析 以 Trizol 法提取洋葱抽薹初期的花序分生组织的总 RNA，参照 MBI 公司的 M-MLV Reverse Transcriptase 使用说明合成 cDNA； 使用 Primer Premier 5.0 根据大蒜 （Allium sativum） 、 水仙 （Narcissus tazetta） 、 风信子 （Hyacinthus orientalis） 、 水稻 （Oriza sativa） 、 葡萄 （Vitis vinifera） 和拟南芥 （Arabidopsis thaliana）等 LEAFY 同源序列保守区设计兼并引物 LFYP-F 和 LFYP-R，PCR 扩增中间片段。根据中 间片段测序结果设计 GSP3-1、 GSP3-2 和 GSP5-1、 GSP5-2 等 4 条巢式引物， 结合 3-Full RACE Core Set Ver.2.0、5-Full RACE Kit 使用说明进行 RACE 克隆。扩增产物链接 pEASY-T3 载体，转化大肠 杆菌感受态，蓝白斑筛选阳性克隆，经菌落 PCR、酶切鉴定后送华大基因测序。拼接测序结果后设 计 cDNA 全长引物 AcLFYORF1 和 AcLFYORF2，TaKaRa LA Taq DNA 聚合酶扩增全长后测序。应 2 期 叶阳阳等：洋葱开花相关基因 AcLFY 的克隆与表达分析 285 用生物信息学软件进行序列分析。 表表 1 引物序列引物序列 Table 1 Primers and their sequence 引物 Primer 序列（53） Sequence（53） 用途 Description LFYP-F T（G/C）TTCCG（G/C/T）TGGGA（G/C） （G/C）T（A/G/C）CTC（G/C）TCGG LFYP-R GAACGGGTGCTCCCT（C/T）TGCC（G/T）CTCC AcLFY 中间片段的分离 Isolation of AcLFY fragments GSP3-1 TGTGGCAGGTGAAGGAGA GSP3-2 GTCGGATGGAAGCGGAGTC 3RACE GSP5-1 AATCCGTCTCCTGCTCTCCTTCA GSP5-2 TCGCTCTTCTGATATTCCTTCCTGA 5RACE AcLFYORF1 AACTGCAGATGGACCCAACAGACCCCTA AcLFYORF2 CGGGATCCCATTAGAACATAGAGGACACAGA AcLFY 开放阅读框的扩增 Amplification of AcLFY ORF AcLFY-F TCACCCCCAGCACTCTCTTAGGC AcLFY-R CTGACTCCGCTTCCATCCGACTC 荧光定量检测引物 Real-time RT-PCR of AcLFY AcActin-F ACACGGCCTGGATAGCAACAT AcActin-R AGAGCAGTATTCCCAAGCATT 荧光定量内参引物 Real-time RT-PCR of AcActin 1.3 AcLFY 基因的定量表达分析 分别提取洋葱抽薹初期的花序分生组织和叶片，抽薹期的小花苞、花柄、花托和叶片，开花期 的花、花柄、花托和叶片的总 RNA，参照 M-MLV RT 使用方法反转录成 cDNA 模板，稀释 5 倍后 备用。 将 AcLFY 基因 cDNA 测序结果输入 GenBank 数据库进行 Blast 比对， 为避免引物与其他 LEAFY 家族基因结合，选取一段非保守区设计一对特异性引物 AcLFY-F 和 AcLFY-R，产物长度为 300 bp 左右。 按照 SYBR Premix Ex Taq操作说明， 以 AcActin （GU570135） 为对照 （Song et al.， 2010） ， 在 Bio-Rad iQ5 荧光定量 PCR 仪上进行 PCR 扩增，检测基因的相对表达量。 荧光定量 PCR 反应体系为 20 L：2 SYBR Premix Ex Taq10 L，引物各 1 L，cDNA 模 板 1 L，超纯水 7 L，混合加样。PCR 反应程序为 96 预变性 1 min，95 变性 15 s，60 退火 15 s，72 延伸 45 s，40 次循环。每个试验设置 3 次重复。 1.4 洋葱 AcLFY 基因生物信息学分析方法 克隆序列经 GenBank 中的 BLAST 进行同源序列查找，采用 DNAMAN 软件进行同源性比对； 使用 MEGA5.1 软件进行同源序列系统发育树的构建；通过 CBS 和 NPS 服务器上的 SOPMA、 TMHMM、SignalP 4.0、NetPhos 2.0 等程序对 AcLFY 基因进行理化性质和序列结构分析。 2 结果与分析 2.1 AcLFY 基因的克隆与氨基酸序列结构分析 以花序分生组织总 RNA 反转录的 cDNA 为模板， 利用兼并引物 LFYP-F 和 LFYP-R 扩增得到 1 个 324 bp 的中间片段（图 1） 。根据中间片段设计 RACE 引物，分别从 3端和 5端扩增出 1 个约 700 bp 的序列和 1 个近 600 bp 的序列，获得拼接结果后针对编码区设计特异性引物 AcLFYORF1 和 AcLFYORF2， 扩增出 1 个 1 119 bp 的 cDNA 序列， 其中 A、 T、 G、 C 4 种碱基含量分别为 27.2% （A） ， 21.1%（T） ，27.2%（G）和 24.6%（C） 。 NCBI数据库检索结果表明， 该序列属于FLO LFY基因超家族。 该cDNA序列被命名为AcLFY， 已经登录 GenBank，登录号为：JX275962。 286 园 艺 学 报 40 卷 图图 1 AcFLY 基因基因 RT-PCR 和和 RACE 扩增结果扩增结果 M：DL 2000 ladder；A：中间片段；B：3RACE 巢式扩增结果；C：5RACE 巢式扩增结果； D：AcLFY 编码区 PCR 产物。 Fig. 1 The RT-PCR and RACE amplification result of AcLFY gene M：DL 2000 ladder；A：Middle fragment；B：The nested PCR amplification result of 3RACE； C：The nested PCR amplification result of 5RACE； D：The PCR product of AcLFY open reading frame. AcLFY 基因具有 1 个完整的开放阅读框， 编码 372 个氨基酸。 该氨基酸序列分子量为 42 215.8 D， 等电点为 8.68。 通过 NPS 服务器上的 SOPMA 程序对其二级结构进行预测，发现该蛋白主要由 螺旋和无规 则卷曲组成，其中 螺旋、 折叠、 转角和无规则卷曲的含量分别占 40.32%、16.13%、10.22% 和 33.33%。 经 CBS 服务器上的 SignalP 4.0 和 TMHMM 分析，该氨基酸序列无信号肽结构，且未形成跨膜 蛋白结构域，说明 AcLFY 蛋白不属于膜蛋白或分泌蛋白。 使用 CBS 网站的 NetPhos 2.0 对该序列进行磷酸化位点分析，结果显示有 12 个 Ser（21SPPL、 118SDVP、126SQEG、131SEER、139SGGE、151SVTC、158SNKK、184SDSE、186SESD、188SDGS、191SGVR、 267SYIN） ，3 个 Thr（77TLSH、153TCKK、197TERQ） ，3 个 Tyr（7YTHS、92YGIK、268YINK）可能成 为蛋白激酶磷酸化位点。 AcLFY 基因编码的 372 个氨基酸中有 22 个脯氨酸，在 5-N 端的前 33 个氨基酸中，脯氨酸的含 量就高达12个， 具有明显的5-N端脯氨酸富集区； 第55 86个氨基酸之间的序列符合 “XELXTL XEL”结构特征，是 1 个亮氨酸拉链结构；第 68 73 个氨基酸是由连续的带负电的天冬氨酸和谷 氨酸组成的，即酸性区。 AcLFY 基因这些结构都符合 FLO LFY 基因超家族的结构特征。 另外 AcLFY 基因还含有赖氨酸 富集区。 2 期 叶阳阳等：洋葱开花相关基因 AcLFY 的克隆与表达分析 287 图图 2 AcLFY 基因的基因的 cDNA 序列和推测的氨基酸序列序列和推测的氨基酸序列 ATG 表示起始密码子；TAA 表示终止密码子；灰色部分表示脯氨酸富集区； D E E L D D 表示酸性区； “ ”表示赖氨酸富集区； “ ”表示亮氨酸拉链结构。 Fig. 2 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of AcLFY ATG means initiator codon；TAA means terminator codon；The gray region means proline-rich region； D E E L D D means acidic region；The region with“ ”means lysine-rich region； The region with“ ”means the leucine zipper. 2.2 AcLFY 的同源序列比对和系统发育树构建 同源序列比对分析表明，AcLFY 与水仙 NFL 和风信子 HLY 有较高的同源性，分别为 69.7%和 65.2%；与拟南芥 LEAFY 和金鱼草 FLO 蛋白的同源性也高达 55%和 55.3%；与水稻、小麦、葡萄、 蝴蝶兰、玉米和麝香百合等 LEAFY 类蛋白的同源性也在 50% 60%之间，可见 LEAFY 基因在长期 的进化过程中是高度保守的。 对单子叶植物 LEAFY 氨基酸序列比对观察后发现，它们都具有一个共同的赖氨酸富集区（图 3） ，而大部分双子叶植物的 LEAFY 蛋白不具有这样的结构。 288 园 艺 学 报 40 卷 图图 3 不同植物不同植物 LEAFY 氨基酸序列同源性比对氨基酸序列同源性比对 AcLFY：洋葱；HLY：风信子；FLY：蝴蝶兰；LFY1：麝香百合；RFL：水稻；NFL：水仙；FL-1：玉米。 Fig. 3 Alignment of deduced amino acid sequences of LEAFY from different plants AcLFY：Allium cepa L.；HLY：Hyacinthus orientalis；FLY：Phalaenopsis hybrid；LFY1：Lilium longiflorum； RFL：Oryza sativa；NFL：Narcissus tazetta；FL-1：Zea mays. 利用 MEGA5.1 软件，将洋葱 AcLFY 氨基酸序列与 GenBank 数据库中已登录的 21 种高等植物 的 LEAFY 氨基酸序列构建（bootstrap）neighbor joining（NJ）树（图 4） 。结果显示，洋葱与水仙和 风信子的亲缘关系最近，其次是蝴蝶兰、玉米和水稻；从系统发育树中可以清晰地看出被子植物与 裸子植物在 LEAFY 的进化上属于两个并列的分支，而被子植物中又存在双子叶植物和单子叶植物 两个分支，说明 LEAFY 是植物进化过程中出现较早的基因，随着植物的进化，LEAFY 的结构也在 分化，并且在亲缘关系很远的植物之间也是相当保守的。 2 期 叶阳阳等：洋葱开花相关基因 AcLFY 的克隆与表达分析 289 图图 4 不同植物不同植物 LEAFY 氨基酸序列系统发育树分析氨基酸序列系统发育树分析 Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of deduced amino acid sequences of LEAFY from different plants 2.3 AcLFY 时空表达的 qPCR 检测 实时荧光定量 PCR 结果经 iQ5 软件分析，扩增量动力学曲线基线平整，指数区明显，斜率大且 固定，呈标准的 S 型荧光定量动力学曲线，说明所建立的检测方法有良好的灵敏性和准确性；溶解 曲线均呈现单一波峰，说明与 SYBR Green荧光染料结合的为目的片段，定量检测扩增产物的特 异性较好。图 5 为以 AcActin 为对照的 AcLFY 不同时空的表达情况。 图图 5 洋葱洋葱 AcLFY 基因的时空表达特性基因的时空表达特性 1、2：抽薹初期叶片、花序分生组织；3、4、5、6：抽薹期叶片、花柄、花托、花苞；7、8、9、10：开花期叶片、花、花柄、花托。 Fig. 5 Spatiotemporal expression patterns of AcLFY gene in onion 1，2：Leaf，inflorescence meristem at the beginning of bolting；3，4，5，6：Leaf，flower pedicel，floral receptacle， flower bud in bolting time；7，8，9，10：Leaf，flower，flower pedicel，floral receptacle in flowering time. 290 园 艺 学 报 40 卷 结果显示，在洋葱抽薹及开花的各时期中均检测到 AcLFY 的表达，在抽薹初期的花序分生组织 中表达量达到最大，抽薹期在花托、花柄以及成形和未成形的花器官中只有微量表达，开花期在花 器官中检测到微量的表达，而在叶片中的表达量较大，说明花器官完全形成后，AcLFY mRNA 主要 存在于叶片中。随着花器官的发生至发育完成，叶片中 AcLFY 的表达呈增多的趋势。 3 讨论 LEAFY 基因最早是被 Coen 等（1990）利用转座子标签法从金鱼草中分离出来的，目前已从 30 多种作物上克隆了 LEAFY 的同源基因。该基因编码 360 438 个氨基酸，氨基酸序列之间的保守性 较高，且大部分含有 5-N 端脯氨酸富集区、中央酸性区和亮氨酸拉链结构，符合转录因子的结构特 点。此外，本研究对单子叶植物 LEAFY 基因进行序列分析发现，它们都共有一个赖氨酸富集区，这 是双子叶植物 LEAFY 基因所不具备的，该赖氨酸富集区对 LEAFY 基因的作用机理有怎样的影响， 是否会引起单双子叶植物之间 LEAFY 蛋白的一些共性差异，可否认为此结构是单双子叶植物间 LEAFY 蛋白的一个标志性差异，这些问题都需要更多的科学试验进行论证。 Weigel 等（1992）的原位杂交实验结果表明：LEAFY 表达于非常幼嫩的花序分生组织中，而在 花原基中不存在，在花原基形成早期，整个花分生组织都发现了 LEAFY 的高水平表达，在花器官原 基形成后，表达大部分消失，但是 LEAFY mRNA 在营养器官中广泛存在，部分植物叶原基中也能 检测到 LEAFY 的表达。此后，科研工作者又对 LEAFY 基因的表达做了大量的研究，发现 LEAFY 于 不同物种间的表达模式存在一定的差异，尤其是单子叶植物与双子叶植物之间的差异较为明显（吕 玲玲 等，2011） 。水仙 NLF 基因在由营养生长向生殖生长转化的茎顶端分生组织中有大量表达，在 发育的花药和幼叶中也有表达，成熟的叶片中却检测不到 NLF 的表达（Tal et al.，2010） ；中国水仙 NTLEAFY 基因在营养器官和生殖器官中始终有表达（刘文凤，2009） ；水稻 RLF 基因在幼穗中有表 达，在成熟的花和叶片中没有表达（Kyozuka et al.，1998） ；百合 LiLFY1 基因在幼嫩的花芽和顶端 分生组织中有表达，而在根、茎、成熟的叶片和成熟花的各轮器官中不表达（王爱菊 等，2008） ； LEAFY 在草莓花芽中的表达量最高，在营养生长的组织中基本不表达，在成熟花器官中同样不表达 （刘月学 等，2012） 。本研究结果显示，洋葱 AcLFY 基因在花序分生组织中有大量表达，花器官形 成后，AcLFY 大多累积于叶片之中。 综上可见，即使是在单子叶植物纲之间比较，LEAFY 基因的表达模式也不尽相同。大部分单子 叶植物的成熟叶片中都检测不到 LEAFY 基因的表达，但是洋葱和中国水仙的成熟叶片中却发现了 LEAFY 基因的表达，引起这种表达差异的原因还有待进一步的研究。 References Ahean K P， Johnson H A， Weigel D， Wagner D R. 2001. NFL1， a Nicotiana tabacum LFY like gene， controls meristem initiation and floral structure. Plant and Cell Physiology，42：11301139. Christian J，Andreas E M. 2009. Flowering time control and applications in plant breeding. Trends in Plant Science，14 (10)：563573. David P，Levi Y，Markus S. 2012. The end of innocence：Flowering networks explode in complexity. Current Opinion in Plant Biology，45： 4550. Coen E S，Romero J M，Doyle S，Elliott R，Murphy G，Carpenter R. 1990. Floricaula：A homeotic gene required for flower development in Antirrhinum majus. Cell，63：311322. Kyozuka J，Konishi S，Nemoto K. 1998. Down-egulation of RFL，the FLO/LFY homolog of rice，accompanied with panicle branch initiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA，95：19791982. 2 期 叶阳阳等：洋葱开花相关基因 AcLFY 的克隆与表达分析 291 征 订征 订 Leandro P，Mar M T，Jose J，Jose A P，Luis N. 2001. Constitutive expression of Arabidopsis LEAFY or APETALAl genes in citrus reduces their generation time. Nature Biotechnology，19：263267. Liu Wen-feng. 2009. Isolation and expression analysis of the NTLEAFY and NTA gene in Narcissus tazetta var. chinensis RoemM. D. Dissertation. Beijing：Beijing Forestry University. (in Chinese) 刘文凤. 2009. 中国水仙 NTLEAFY 与 NTA 基因的克隆及表达分析硕士论文. 北京：北京林业大学. Liu Yue-xue，Zou Dong-mei，Li He，Zhang Zhi-hong，Ma Yue，Dai Hong-yan. 2012. Isolation and expression analysis of LFY homologue from strawberry. Acta Horticulturae Sinica，39 (5)：861868. (in Chinese) 刘月学，邹冬梅，李 贺，张志宏，马 跃，代红艳. 2012. 草莓LFY同源基因的克隆及其表达分析. 园艺学报，39 (5)：861868. L Ling-ling，Sun Guang-ming，Liu Yu-ge，Wei Chang-bin，Liu Sheng-hui，Duan Jun. 2011. Progress of LEAFY homologous gene study. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，31 (1)：197203. (in Chinese) 吕玲玲，孙光明，刘玉革，魏长宾，刘胜辉，段 俊. 2011. LEAFY 同源基因研究进展. 西北植物学报，31 (1)：197203. Ng M，Yanofsky M F. 2000. Three ways to learn the ABCs. Current Opinion in Plant Biology，3：4752. Sarah J L， Cindy G B， Anusak P， Gary S D， Martin F Y. 1999. Interactions among APETALA1， LEAFY and TERMINAL FLOWER1 specify meristem fate. The Plant Cell，11：10071018. Song Q，Zhao F K，Sun Q P，Yang A Z. 2010. Cloning and expression of functional region of AcNAC transcription factor gene in onion. First International Conference on Cellular，Molecular Biology，Biophysics and Bioengineering（CMBB） ，4：403407. Tal N P，Rina K，Amram E，Moshe A F. 2010. Temporal and spati