二维液相色谱法在线检测哈茨木霉发酵液中2460 A含量.pdf

第 4 2卷 2 0 1 4年 1 2月 分析化学 ( F E N XI H UA X U E ) 研究简报 Chi n e s e J o urna l of Ana l yt i c a l Che mi s t r y 第 1 2期 1 8 281 83 2 DOI ： 1 0 1 1 8 9 5 j i s s n 0 2 5 3 - 3 8 2 0 1 4 0 7 5 5 二维液相色谱法在线检测哈茨木霉发酵液 中 2 4 6 0 A含量 山广志 周 洁 左利民 姜 威 刘桂霞 张 洋 李 元 姜 蓉 ( 中国医学科学 院医药生物技术研究所 ， 北京 1 0 0 0 5 0 ) 摘要建立了在线检测哈茨木霉发酵液中微量 2 4 6 0 A的二维液相色谱方法。利用 U l t i m a t e 3 0 0 0双三元液 相色谱仪， 采用阀切换二维色谱技术， 组合 3根色谱柱实现2 4 6 0 A的在线净化 、 富集和含量检测。净化柱采用 资生堂 M F C 8 柱( 1 0 m m4 6 m m， 5 0 ) ， 富集柱采用资生堂 MG C 8 柱( 2 0 m m4 6 m m， 5 0 Ix m) ， 以水一 甲醇为流动相 ， 梯度洗脱 ， 流速 2 0 m L mi n ； 二维分析柱采用 T h e r m o H y p e r s i l G O L D C ， 柱 ( 2 5 0 mm4 6 m m， 5 0 m) ， 以水一 甲醇为流动相， 梯度洗脱， 流速 1 0 m L mi n ；进样量 1 0 m L ；柱温 4 0； 检测波长 4 2 4 n m。 方法验证结 果显示 ， 2 4 6 0 A的线性范围为 0 0 0 2 51 0 0 m g L ( r = 0 9 9 8 1 ， n = 8 ) ， 检 出限为 1 2 L ； 定 量限 为2 5 g L ；方法回收率为 8 8 0 一1 0 4 4 。 关键词二维液相色谱；哈茨木霉 ； 发酵液； 2 4 6 0 A 1 引 言 2 4 6 0 A是从植物病原菌拮抗菌哈茨木霉 ( T r i c h o d e r ma h a z i a n u m) 的发酵产物中分离获得的一种具有 抗肿瘤活性的新结构化合物 ， 结构见图 1插图。2 4 6 0 A具有 白细胞介素 6受体 ( I L 一 6 R) 的配基活性 ， 同 时对骨髓癌 C M1 2 6细胞和结肠癌 H T - 2 9细胞具有抑制作用 。 2 4 6 0 A水溶性较差( 水中溶解度 1 mg L ) ， 采用常规分析型 H P L C方法在进样量 1 0 0 I x L条件下仅 能达到定量限水平 。哈茨木霉发酵液基质较为复杂 ， 严重干扰 目标物的分离 。为了研究和优化 2 4 6 0 A 的发酵工艺， 需要对不同发酵条件下哈茨木霉发酵液中的 2 4 6 0 A含量进行测定。采用传统液液萃取方 法进行样品预处理时， 需要发酵液样品量较大 ， 操作步骤繁琐 ， 耗时较长 ， 难以满足发酵工艺优化所需的 快速 、 准确的检测要求 。 近年来 ， 由普通 一维液相 色谱 发展起 来 的多维 液相色谱 技术有力 地推动 了复杂体 系成分 的分 离 - 3 J 。G i d d i n g 等 指出， 多维色谱分离系统比一维色谱具有更好的分辨率和更高的峰容量 ， 更适合 分离复杂体系。本研究利用 U l t i m a t e 3 0 0 0双三元液相色谱仪 ， 采用六通阀切换技术 ( 见图 2 ) J 、 大体 积进样器和 3根色谱柱 ， 综合利用“ 中心切割” 、 在线富集等二维色谱技术 ， 实现 了复杂发酵液的在线预 处理 ， 减轻 了实验人员操作强度 ， 节约了样品处理时间， 提高了检测的 自动化程度和通量 ， 方法重现性较 手动提取得到较大提高。通过大体积进样和在线富集， 提高了方法灵敏度， 解决了微量组分的检测难 题 。建立 的方法准确 、 简便 、 灵敏 、 通用性强 ， 适用于 2 4 6 0 A发酵工艺优化过程 中的大量检测研究工作 ， 同时为复杂基质中微量代谢产物的测定提供 了方法依据和借鉴 。 2 实验部分 2 1 仪器与试剂 U h i Ma t e 3 0 0 0液相 色谱 系统 ( 配 有双 三元 泵、 在线 脱气 机 、 自动进 样器 、 柱温 箱 、 u V检 测器 和 C h r o m e l e o n工作站 ， 美国 T h e r m o F i s h e r S c i e n t i fi c公司) ； X P 2 0 5天平 ( 瑞士 Me t t l e r T o l e d o 公 司) ； I n t e g r a l 1 0 Mi l l i Q超纯水仪( 德 国 Me r c k Mi l l i p o r e 公司) 。 甲醇( 批号： 1 6 7 4 6 0 7 3 0 8 ， 色谱纯， M e r c k 公司) 。实验用水为超纯水。 2 4 6 0 A对照品( 批号 ： 0 3 0 1 ) 及发酵液 ( 批号 ： 0 5 0 3 、 0 5 2 3 、 0 6 2 4 ) 由中国医学科学 院医药生物技术研 2 0 1 4 - 0 8 - 2 9收稿 ； 2 0 1 4 1 0 - 2 0接受 本文系科技部新 药创制重大专项平 台资助项 目( N o 2 0 1 2 z x 0 9 3 0 1 0 0 2 - 0 0 1 - 0 1 9 ) E ma i l ： s h a n g u a n g z h i i mb p u re e e d u (2 12 ；j r 5 6 0 2 1 6 3 c o rn 第 1 2期 山广志等：二维液相色谱法在线检测哈茨木霉发酵液中2 4 6 0 A含量 究所生物工程室和微生物化学室提供 。 2 2溶液的配制 2 2 1 对照品储备液的配制 准确称取 2 4 6 0 A对 照品 1 0 0 0 m g ， 用 甲醇溶解并定容至 5 0 m L， 即得 2 0 0 0 m g L的对照品储备液。 2 2 2 系列对照品溶液的配制 准确移取适量 2 4 6 0 A对照 品储备液 ， 以水逐级稀释 ， 配制浓度分别 为 1 0 0 0 ， 2 0 0 0， 1 0 0 0 ， 0 5 0 0 0 ， 0 1 0 0 0 ， 0 0 5 0 0， 0 0 1 0 0， 0 0 0 5 0和 0 0 0 2 5 mg L的2 4 6 0 A系列对照品溶液。 2 2 3 供试品溶液的配制取发酵液原液 ， 以 4 5 0 0 r m i n离心 1 5 mi n ， 上清液用 0 2 2 m滤膜过滤 ， 以续滤液作为供试 品溶液。 2 3 色谱条件 色谱柱 ： 净化柱采用 资生堂 MF C 。 柱 ( 1 0 m mx 4 6 m m，5 0 m) ， 富集 柱采用资生堂 MG C 柱 ( 1 0 m mx 4 6 m m， 5 0 m) ， 分析柱采用 T h e r m o H y p e r s i l G O L D C 1 8 柱 ( 2 5 0 mmx 4 6 mm， 5 0 m) ； 水 为流动相 A， 甲醇为流动相 B；柱温 ： 4 0 q C； 进样量 ： 1 0 mL ； 检测波长 4 2 4 n m。梯度洗脱程序及阀切 换时间见表 1 。 表 1 梯度洗脱程序与阀切换时间 T a b l e 1 G r a d i e n t p r o g r a ms a n d v a l v e s w i t c h i n g t i me 3结果与讨 论 3 1方法的选择 由于发酵液的基质较为复杂 ， 常规检测方法一般需经多步提取 、 浓缩或富集后 ， 方能进行检测。且 样品前处理操作繁琐 ， 耗时较长 ， 并伴 随样 品损失 ， 在进行大批样 品含量检测时难 以保证实验的高效性 和检测结果的准确性。 哈茨木霉发酵液中 2 4 6 0 A极性较小 ， 难溶于水 ， 常规进样量条件下难 以有效进行定量检测 。为了 提高检测灵敏度 ， 尝试采用制备型大体积定量环 ， 通过增加进样量提高检测灵敏度。进样 1 0 mL后 ， 发 现哈茨木霉发酵液 中既存在极性较强 的水溶性组分与低极性组分 ， 也存在大量极性类似于 2 4 6 0 A的组 分 ， 含量较低的 2 4 6 0 A几乎被掩盖。 采用 3根色谱柱 ， 依次对样品进行净化 、 富集和分离工作。净化柱采用“ 中心切割” 技术 ， 使 2 4 6 0 A 与极性相差较大的组分迅速分离 ；富集柱捕获转入的 2 4 6 0 A， 洗脱部分极性相似的杂质 ， 并将 2 4 6 0 A色 谱峰富集在色谱柱入口端， 减少了因大体积进样导致的谱峰展宽； 随后 2 4 6 0 A被反冲人分析柱， 在分析 柱上获得了良好的色谱行为 ， 显著降低 了基质和杂质的干扰 。经本方法处理所得发酵液色谱 图与未经 净化 、 富集直接进样分析获得的发酵液及 2 4 6 0 A对照品色谱图比较 ， 可直观显示 2 D H P L C方法“ 净化” 的效果 ， 见图 1 。利用本方法最终实现了发酵液中微量 2 4 6 0 A的良好分离和定量检测 。 分 析 化 学 第 4 2卷 o L 。 0 图 1 二维液相色谱净化效果 比较 图 F i g 1 C h r o ma t o g r a ms o f f e r me n t a t i o n l i q u o r wi t h a n d wi t h o u t p u r i f i c a t i o n a 发酵液直接进样色谱 图( H P L C c h r o ma t o g r a m o f d i r e c t i n j e c t i o n o f f e r me n t a t i o n ) ； b 2 4 6 0 A对照 品直接进样色谱图 ( H P L C c h r o ma t o g r a m o f d i r e c t i n j e c t i o n o f 2 4 6 0 A r e f e r e n c e s u b s t a n c e ) ； C 发酵液 2 D - H P L C色谱图( 2 D- HP L C c h r o m a t o g r a m o f f e r me n t a t i o n ) 。 3 2色谱柱的选择 本实验采用保留能力相对较弱的 1 0 mm C 柱作为净化柱 ， 既可迅速除去发酵液中的大量水溶性杂 质 ， 又可快速洗脱“ 中心切割” 后极性弱于 2 4 6 0 A的组分 ， 在较短时间内实现色谱柱 的再平衡 。 由于采用大体积进样 ， 富集柱长度对检测结果 的准确性存在影响。采用较短色谱柱 ( 1 0 m m) 在高 流速状态下， 难以完整捕获目标物， 导致回收率较低。采用保留能力较强的2 0 m m C ls 柱作为富集柱， 能 有效捕获并浓缩 目标组分 ， 使得 2 4 6 0 A反冲入分析柱后获得更加优 良的色谱峰， 同时 ， 富集过程中部分 极性相似杂质也得到有效去除。 经过净化 、 富集后 ， 2 4 6 0 A和少量杂质进入常规 C 分析柱( 2 5 0 mm4 6 mm) 分 析 ， 虽然杂质在 4 2 4 n m波长处检测响应较低 ， 但对准确定量 2 4 6 0 A存在干扰 ， 通过梯度洗脱 ， 实现了 2 4 6 0 A与相近杂 质的 良好分离。 3 3 检测波长的选择 2 4 6 0 A的紫外吸收光谱存在 4个吸收峰分别位于 5 1 4 ， 4 2 4 ， 2 7 9和 2 4 6 n ml 1 J 。其 中 4 2 4 n m波长处 紫外吸收较强 ， 且基质干扰较低 ， 本实验最终选用 4 2 4 n m波长作为 2 4 6 0 A的检测波长。 3 4 阀切换时间的选择 本研究采用 阀切换二维色谱技术 ， 利用 U 3 0 0 0系统进行在线净化 与分析。通过实验确定 3次阀切 换时间分别为9 5 ， 2 2 0和 2 9 0 m i n ， 整个分析过程分为以下 4个步骤 ： ( 1 )0 9 5 m i n ： 六通阀“ 1 - 2 ” 连 接 ， 发酵液 中水溶性杂质被洗脱 ， 2 4 6 0 A及极性相近组分保 留在净化柱 中， 富集柱及分析柱处于平衡过 程 ；( 2 )9 5 2 2 0 mi n ： 六通 阀“ 1 - 6 ” 连接 ， 2 4 6 0 A及极性相似组分 由净化柱顺 冲至富集柱 ， 在 富集柱上 洗脱掉大部分极性相近杂质 ， 2 4 6 0 A及少部分极性相似 的成分保 留在富集柱中， 此时分析柱处于平衡过 程 ；( 3 )2 2 0 2 9 0 mi n ： 六通阀“ 1 - 2 ” 连接 ， 2 4 6 0 A及部分极性相似组分被反 冲进分析柱 ， 净化柱进行 清洗 ； ( 4 )2 9 0 5 5 0 mi n ： 六通阀 “ 1 -6” 连接 ， 分析柱进行 2 4 6 0 A的分离与检测 ， 净化柱与富集柱进行 清洗和平衡 。六通 阀连接如图 2所示。 3 5 专属性考察 准确移取空 白溶剂 、 1 0 0 0 L对照品溶液和供试品溶液各 1 0 mL ， 分别进行检测 。结果表明 ， 在 4 2 4 n m处 ， 2 4 6 0 A对照品于 4 4 9 mi n出峰 ， 空 白溶剂在相应保 留时间位置未见色谱峰 ， 不干扰 2 4 6 0 A 的测定 。 3 6 方法线性范 围及检出限和定量限 取 2 4 6 0 A系列 对照 品溶液各 1 0 mL分别进样 ， 记 录色谱 图 ， 以系列对照 品溶 液 中 2 4 6 0 A浓度 ( L ) 为横坐标( ) ， 2 4 6 0 A的峰面积为纵坐标( Y ) ， 进行线性 回归， 线性方程为 Y = 0 0 3 1 7 x 2 2 8 7 6 ( r = 0 9 9 8 1 ， n = 8 ) ， 2 4 6 0 A在 0 0 0 2 51 O 0 0 mg L范围内呈 良好的线性关系。 第 1 2期 山广志等： 二维液相色谱法在线检测哈茨木霉发酵液中2 4 6 0 A含量 1 8 3 1 图 2 六通 阀转换不意 图 Fi g 2 Di f f e r e nt po s i t i t i o n o f t he s i x p o r t s wi t c hi ng v a l v e 本方法检出限为 1 2 g L ( S N= 3 ) ， 定量限为 2 5 L ( S N=1 0 ) 。 3 7 精密度和方法 回收率 取 2 0 0 g L 2 4 6 0 A对照品溶液 ， 连续进样 6针检测 ， 2 4 6 0 A峰面积 的 R S D=1 8 。 取 3 3节制备的供试品溶液( 批号 0 5 0 3 ) 5 0 m L于 1 0 m L容量瓶中， 分别加入 1 0 0 0 g L对照品溶 液 1 0 ， 2 0和 4 0 mL ， 用水定容 ， 每个浓度平行 3份。采用本方法进样测试 ， 记录色谱 图。代入线性方 程计算浓度 ， 以测得加入量 ( 测得量与发酵液原有量之差 ) 与实际加入量的比值计算回收率 ， 3种浓度 的 平均回收率分别为 1 0 4 4 ， 1 0 4 4 和 8 8 0 ， R S D分别为 1 3 ， 2 8 和 1 9 。 3 8 样品测定 取 3 3节制得的 3批供试品溶液 ， 照上述色谱条件进样测定 ， 记录色谱 图， 将供试 品溶液色谱 图中 2 4 6 0 A峰面积带入线性方程 ， 按标准 曲线法分别 计算 3批样 品中 2 4 6 0 A的含量 。结果表 明， 批 号为 0 5 0 3， 0 5 2 3和 0 6 2 4的发酵液 中2 4 6 0 A的含量分别为 6 4 3， 6 3 7和 5 5 3 g L 。 经方法学验证 ， 本方法操作简便 ， 专属性强 ， 灵敏度高， 重复性好 ， 在考察的浓度范围内呈线性响应 ， 可用于发酵液 中2 4 6 0 A含量的监测 ， 为 2 4 6 0 A发酵工艺的优化 ，以及发酵液中微量代谢产物的快速测 定提供 了参考。 Re f e r e nc e s 1 Q I X i a o Q i a n g ， Z HU F e n g C h a n g ， Z H A N G Y a n g ， G U O L i a n Ho n g ， J I A N G R o n g ， HE Q i Y a n g ， L I Y u a n A c t a P h a r ma - c e u t i c a S i n i c a，2 0 1 1，4 6( 2) ：1 6 5 1 6 9 齐小强 ， 朱凤昌， 张 洋， 郭连宏 ， 姜 蓉， 何琪杨 ， 李 元药学学报， 2 0 1 1 ， 4 6 ( 2 ) ： 1 6 5 1 6 9 2 A b d a l l a K 0， R a f u d e e n M S P r o t e o m i c s ， 2 0 1 2 ， 7 5 ( 8 ) ： 2 3 6 1 2 3 7 4 3 L o n g Z， G u o Z ，X u e X， Z h a n g X，L i a n g X S e p a r a t i o n S c i e n c e ， 2 0 1 3 ， 3 6 ( 2 4 ) ： 3 8 4 5 - 3 8 5 2 4 D a v i s J M，G i d d i n g s J C A n a 1 C h e m ， 1 9 8 3， 5 5 ( 3 ) ： 4 l 8 4 2 4 5 D a v i s J M，G i d d i n g s J C A n a 1 C h e m ， 1 9 8 5， 5 7 ( 1 2 ) ： 2 1 6 8 - 2 1 7 7 6 L I U L e i ，WE N Y a B i n ，L I U K a n g N i n g ，L U Y a X i n ，Y I N Z h e n g C h i n e s e J o u r n a l o f P h a r ma c e u t i c a l A n a l y s i s ， 2 0 1 2 ， 3 2 ( 2 ) ： 2 0 6 - 2 2 0 刘 磊，温亚彬 ， 刘康宁 ， 卢亚欣， 尹 正药物分析杂志， 2 0 1 2 ， 3 2 ( 2 ) ： 2 0 6 2 2 0 1 8 3 2 分 析 化 学 第 4 2卷 7 MA H a o ， H E We i ， Y A N G L i u ， Y I N X u e M e i ， WA N G We n J i a ， S HI C h a o O u C h i n e s e J o u r n a l o f C h r o m a t o g r a p h y ， 2 0 1 2 ， 3 0 ( 1 2 ) ： 1 2 8 2 - 1 2 8 6 马 浩， 贺 伟， 杨 柳 ， 尹雪梅，王文佳 ， 施超欧色谱 ， 2 0 1 2 ， 3 0 ( 1 2 ) ：1 2 8 2 - 1 2 8 6 8 L I X i a o N a ， Y u N i n g ， Z H A N G J i a n Me i ， L I N We n S i ， L I N G X i a o Me i ，F U G e ， L I R u n T a o ， C U I J i n g R o n g J o u r n a l of C h i n e s e P h a r m a c e u t i c a l S c i e n c e s ， 2 0 1 2， 2 1 ( 2 ) ： 1 5 6 1 6 1 李晓娜，于 宁，张建美， 林文斯 ， 凌笑梅，富 戈 ， 李润涛， 崔景荣中国药学， 2 0 1 2 ， 2 1 ( 2 ) ： 1 5 6 1 6 1 9 L A N T a o ， J I A O F e n g L o n g ， T A N G T a o ， WA N G F e n g Y u n ， L I T o n g ， Z H A N G We i B i n g C h i n e s e J o u r n a l o f C h r o ma t o g r a p h y ， 2 o o 8， 2 6 ( 3 ) ： 3 7 4 3 7 7 兰 韬 ，焦丰龙 ， 唐 涛 ，王风云 ， 李 彤 ，张维 冰色谱 ， 2 0 0 8 ， 2 6 ( 3 ) ： 3 7 4 3 7 De t e r m i na t i o n o f 2 4 6 0A i n Tr i c ho de r m a Ha z i a nu m Fe r m e n t a t i o n Li q uo r b y On- l i n e Two- di m e n s i o na l Li qu i d Chr o ma t o g r a p hi c M e t ho d S HAN Gu a n g Z h i ，Z HOU J i e ，Z UO L i Mi n，J I ANG We i ，L I U Gu i Xi a ，Z HANG Ya n g，L I Y u a n，J I ANG Ro n g ( I n s t i t u t e o f Me d i c i n a l B i o t e c h n o l o g y ， C h i nes e A c a d e m y of Me d i c a l S c i e n c e s ， B e ij i n g 1 0 0 0 5 0， C h i n a ) A b s t r a c t A n o n l i n e t w o d i me n s i o n a l l i q u i d c h r o ma t 0 g r a p h i c( 2 D - L C )m e t h o d w a s e s t a b l i s h e d b y u s i n g a n u l t i ma t e d u a l g r a d i e n t l i q u i d c h r o ma t o g r a ph y，t h r e e c h r o ma t o g r a p h i c c o l u mn s a n d v a l v e s wi t c h i ng t e c h no l o g y t o d e t e c t 2 4 6 0 A i n t r i e h o d e r m a h a z i a n u m f e r m e n t a t i o n l i q u o r MF C 8 c o l u m n ( 1 0 mmx 4 6 m m， 5 0 m) w a s u s e d a s p u ri fi c a t i o n c o l u m n a n d MG C 1 8 c o l u m n( 2 0 m mx 4 6 m m，5 0 Ix m)w a s u s e d a s e n ri c h i n g c o l u mnMe t ha n o l a n d wa t e r we r e u s e d a s mo bi l e p ha s e wi t h a g r a d i e n t e l ut i o n a t a flo w r a t e o f 2 0 mL mi n T h e s a m p l e w a s s e p a r a t e d o n t h e T h e r m o H y p e r s i l G O L D C 1 8 c o l u mn( 2 5 0 m mx 4 6 m m， 5 0 Ix m)ma i n t a i n e d a t 4 0 o C u s i n g m e t h a n o l a n d w a