农作物品种试验技术规程+玉米.pdf

i c s6 5 .0 2 0 b04 nt 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 ny / t 1 2 0 9 一2 0 0 6 农作物品种试验技术规程玉米 re g u l atio ns fort he m aiz e v a r i e ty 奴 ( zeam ays tes tso fn e l d c r o p l . ) 2 0 0 6 一 1 2 一 0 6 发 布2 0 0 7 一 0 2 一 0 1 实施 中 华 人 民 共 和 国 农 业 部发 布 n、 一 / t 1 2 0 9 一2 0 0 6 月 ij吕 本标准附录a、 附录b 、 附录c 、 附录d、 附录 e 、 附录 f 、 附录 g、 附录 h、 附录 1 、 附录 j 为规范性附 录。 本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。 本标准起草单位: 全国农业技术推广服务中心、 辽宁省农业科学院、 丹东农业科学院、 沈阳农业大 学、 辽宁省种子管理局、 北京市农林科学院玉米研究中心、 辽宁省铁岭农业科学院。 本标准主要起草人: 孙世贤、 王延波、 王金君、 李磊鑫、 景希强、 史振声、 邱军、 陈忠、 杨国航、 王奎森。 本标准由农业部全国农业技术推广服务中心负责解释。 ny/ t 1 2 0 9 一2 0 0 6 农作物品种试验技术规程玉米 t 范围 本标准规 定了玉米( 乙 双刀 川 。 l ， ) 品种试验中试验点选择、 参试品种确定、 试验设计、 田 间管理、 项 目 记载、 数据处理、 报告撰写的 原则和 技术， 评价参试品种的办法。 本标准 适用于国家玉米品 种试验的 设计、 方案制定和组织实施。 2 规范性引用文件 下列文件中 的条款通过本标准的 引用而成为本标准的条款。 凡是注日 期的引用文件， 其随后所有 的 修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根据本标准达 成协议的 各方研 究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 g b1 3 5 3 玉米 g b / t354 3 . 1 一7 农作物种子检验规程 g 1 3 4 4 0 4 . 1 粮食作物种子 禾谷 类 c b / t1 7 3 1 5 玉米杂交种繁育制种技术操作规程 g b 厅 19557 . 1 植物新品 种特异性、 一致 性和稳定 性测试指南 总则 n y / t3 谷类、 豆类作物种子粗蛋白测定法( 半微量凯氏法) n y / t4 谷类、 豆类 作物种子粗脂 肪测定法 n y / tll 谷物籽粒粗淀粉测定法 n y / t56谷物籽粒氨 基酸测定前 处理方法 ny / t523 甜玉米 ny / t524 糯玉米 中华人民共和国农业部 2 0 01 年第44 号令主要农作物品种审定办法 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 预备试验 p re 一 r 雌1var i e t yt ria l 品种试验主管部门为选拔区域试验的参试品种， 在全国 组织的 品种筛选试验。 3. 2 区 域试验 r 馆ionalv arie tytrial 在一定生态区域范围内， 按照统一方案进行的多品种、 多点次的品种试验。 3 . 3 生产试验 yi el d pote n tial 川al 在接近生产田的条件下， 在多点进行的较大面积的品种试验。 3 . 4 生育期 o w t h p e r i ed 从出苗至成熟的生育日 数。 ny/ t 1 2 0 9 一2 0 0 6 4 试验区组的划分和试验点的选择 试验主管部门 依据生态区 划、 农业区划、 品种类型， 结合 生产实际、 耕作制度、 玉米播期类型， 兼顾行 政区划， 确定试验区 组; 依据试验区 组的气候、 土壤和栽培类型， 兼顾承担单位的物质条件和技术力量， 选择试验点。 5 试验设计 5 . 1 小 区面积 区 域试验小区面积)功澎， 种植行数5 行一 6 行; 生产试验小区面积)2 00砰， 8 行镇种植行数( 1 6 行。 5 . 2 小区排列 预备试验小区间比 法排列， 不设重复; 区域试验随机区组设计， 3 次重复; 生产试验间比法排列， 不 设重复。试验地周围设立)4 行保护区。 5 . 3 品种容t 预备试验品种数量镇1 00 个; 区域试验在同一区组内的品种数量(16个( 甜玉米、 糯玉米、 爆裂玉米 等， 根据具体情况 适当 调整) 。生产试验根据实际情况安排品种数量。 5 . 4 对照品种 选 择通过审定的 主栽品种， 每组确定1 个一 2 个。 试验主管 部门 依据程序 组织更换。 5 . 5 种植形式与密度 同一 组别内 的预备试验、 区 域试验密度相同; 生产 试验密度可依 据参试单位的 建议确 定。 6 试验年限 预备试验 1 年; 区域试验 2 年一3 年; 生产试验 1 年一2 年， 可与第二年区域试验同时进行。 7 试验地的选择 选择地势平坦、 土 壤肥力均匀、 前茬作物一致、 具有排灌能力、 有 代表 性的田 块。 8 区域试验品种的确定 依据预备试验结果， 根据区 域试验容量， 按照一定程序确定参加区 域试验品种的 数量和组别。 9 供试种子要求 试验种子质量应符合自3 4 4 04. 1 一19 %， 数量满足试验 需要， 禁止包衣或拌种。 1 0 田间管理 田 间管理水平略高于当 地生产田， 及时中 耕、 施肥、 排灌并防治苗期地下害虫。 在进行田间 操作时， 同一试点、 同一区组、 同一项技术措施在同一天完成。 1 1 记载项目和标准 1 1 . 1 记载项目 普通玉米; 播种期、 出苗期、 抽雄期、 吐丝期、 成熟期、 收获期等， 芽鞘色、 苗势、 株高、 穗位高、 株型等， 双 穗株率、 空秆率、 倒伏率、 倒折率、 保绿度， 病虫害等; 穗型、 穗长、 穗粗、 秃尖、 穗行数、 行粒 数、 粒型、 粒 色、 轴色、 百粒重、 出籽率等。 2 ny/ t 1 2 0 9 一2 0 0 6 特用玉米: 根据品种类型制定相应的记载项目。 1 1 . 2 记载标准 见附录a、 b 、 c 、 d。 1 2 收获和计产 1 2 . 1 区域试验 普通玉米达到成熟期后及时收获。去掉边行及每行行头两株， 收取中间株， 晾晒、 风干后脱粒， 称 重， 折算成标准含水量( 14%) 的 产量。 甜玉米、 糯玉米、 青贮玉米、 爆裂 玉米品 种按试验方案执行。 1 2 . 2 生产试验 全区收获， 折算成标准含水量( 14%) 的产量。 13品质和抗性测试 1 3 . 1 品质检测 试验主管部门指定有关单位定点采集样本， 送交指定的单位检测。 1 3 . 2 抗性鉴定 试验主 管部门 指定专业单位进行鉴定， 所用种子按程序从参试种子中分取。 1 3 . 3 真实性、 特异性及一致性检测 试验主管部门指定专业单位采用 d n a指纹技术进行检测， 所用种子按程序从参试种子中分取。 1 3 . 4 试验检查 试验主管部门组织专家对试验实施情况进行检查， 并提交评枯报告和建议。 1 4 试验报告 试验结束后， 承担 单位及时向试验主管部门 和试验区主持单位提供试验、 品质检测和抗性鉴定报 告; 试验主持单位及时汇总结果， 撰写报告; 试验主管部门及时发布试验年度报告。 巧品种的来源和处理 巧. 1 预备试验 1 5 . 1 . 1 品种来源 从省级品种试验中择优选拔。各省具体名额数由试验主管部门依据预备试验容量确定。 1 5 . 1 . 2 品种处理 根据区域试验容量和品种表现， 择优推荐升人区域试验。 1 52 区域试验 巧. 2 . 1 品种来源 从预备试验中择优选拔或省级种子管理 部门推 荐。 巧. 2 . 2 品种处理 区域试验采用滚动方式进 行， 对第一年符合要求的品种推荐参加第二年的区域试验， 同 时安排生产 试验 。 巧. 3 推荐审定 对于完成品种试验程序并符合条件的品种推荐报审。 ny/ t 1 2 0 9一2 0 0 6 附录a ( 规范性附录) 国家普通玉米品种区域试验、 生产试验、 预备试验调查项目和标准 a. 1 物候期 播种期: 播种当天的日期( 以月、 日表示， 下同) 。 出苗期: 小区有 50%穴数的幼苗出土高度 2二一3 c m的日期。 吐 丝期: 小区50%以上的雌穗吐出花丝的日 期。 抽 雄期: 小区50% 以上的植株雄穗顶端露出顶叶的日 期。 成熟期: 小区 如%以上果穗的籽粒出现黑层的日 期。 生育期: 出苗至成熟的生育日数。 月呀尸卜 aaaaaa a. 2 农艺性状 a， 2 . 1 株型: 吐丝后目测， 分平展、 半紧凑、 紧凑型三种。 a . 2 . 2 株高: 乳熟期连续取小区内正常的植株10株， 测量地表到雄穗顶端的高度， 求其平均值， 用厘 米( rm) 表示， 保留整数。 a . 2 . 3 穗位: 同 时测量地表到最上部果穗着生节的高度， 求其平均值， 用厘 米( c m ) 表示， 保留 整数。 a ， 2 . 4 倒 伏率: 乳熟末 期， 植株倾斜度大于45度但未折断的 植株占 该试验 小区总 株数的 百分率。 a . 2 . 5 倒 折率: 乳熟 末期， 果穗以 下部位折断的 植株占 该试验小区 总株数的百分率。 a . 2 . 6 空 秆率: 收获时调 查不结 果穗和果穗结实20粒以下的植株占 全区总株数的百分率。 a . 2 . 7 双 穗率: 收获时调查结有双穗( 每穗结实加粒以上) 的 植株占 全区株数的 百分率。 a ， 2 8 幼苗叶 鞘色: 绿色、 紫色等。 a. 3 果穗性状( 计产样本穗由大至小排列， 取代表性的 10穗测t l 6项) a. 3 . 1 穗长: 穗基部到顶端的长度， 求其平均值， 以厘米( c m) 表示。 a. 3 . 2 穗 粗: 果穗头 尾相间排成 一行， 测量果穗中 部长度， 求 其平均值， 以厘米( cm) 表示。 a. 3 . 3 秃尖长: 果穗顶端不结实部分的长度， 求其平均值， 以厘米( cm ) 表示。 a . 3 . 4 穗 型: 筒型、 锥型。 a . 3 . 5 穗 行数: 果 穗中 部的籽粒 行数， 求其平均值并标明行数变幅。 a 3 . 6 行粒数: 每穗数一中等长度行的粒数， 求其平均值。 a. 3 . 7 粒色: 黄、 白、 橙红、 黄白等。 a. 3 . 8 粒型: 硬粒型、 半马齿型、 马齿型， 以果穗中部籽粒为准。 a . 3 . 9 轴色: 红、 紫、 粉、 白 。 a31d 百粒重: 随机取1 0 0 粒称重， 重复3 次， 取相近两个数值的平均数， 按标准 水分( 14%) 折算百粒 重， 用克( 9 ) 表示。 a. 3 . 11出籽率: 籽粒干重占果穗干重的百分率。 n y/t 1 2 1 2 一2 0 0 6 出苗后 4 o d每隔7d 喷杀虫剂和杀菌剂。 10. 4 种薯田 品种特征特性调查物候、 植物、 生物学特性及病虫害识别，目 测按标准附录h 、 标准附 录 1 、标准附录k执行。 10. 5 种共贮藏期间管理 收获按 9 . 3 . 1 1 、9 . 3 . 1 2 、9 . 3 . 1 3 执行。 1 1 种薯检验 1 1 . 1 检验方法 1 1 . 1 . 1 类病毒用往复双向聚丙烯酞胺凝胶电泳法 ( rp a g e )检验 ( p s t vd )类病毒 1 1 ， 1 . 2 病毒病用酶联免疫吸附 ( e lisa ) 方法进行 ( 1 ， v x 、 p v y 、 p v s 、 p l r v )检验。 1 1 . 13 田间检验。 1 1 . 1 . 3 . 1 原原种的检验，1 0 0 0 0 株以下随机取样2 %， 1 0 0 0 0 株一1 0 0 0 0 0 株1 %，1 0 0 0 0 0 株以 上 0 . 5 %按表 1 取样方法设点，将检验结果记录于表 2中。 表 1 不同盛种田面积的检验点数和检验植株数 面积 ( i n l 产 )检验点数和每点抽取植株数 簇0 . l hn俨随机抽样检验2个点，每点 1 00 株 0 . 1 1 一1】lm尸随机抽样检验5 个点，每点 1 00 株 1 . 1 一s hi l 产 随机抽样检验 10个点，每点 1 00株 )5hi l l2 随机抽样检验 10个点，每点 1 00 株，超出 5 比 1 1 2 的面积，划出另一个检验区， 按本标准规定的不同面积的检验点，抽取株数进行检验。 11. 1 . 3 . 2 一级原 种和二级原种的检验， 全生育期三次检验， 现蕾期、 盛花期， 枯黄期前两周， 允许 率见表3 。 表 2 脱毒种弃田间检验带病植株及混杂植株允许率 1 1 . 2 检验标准 1 1 . 2 . 1 执行 b1 8 1 3 3 1 1 . 3 检验程序 n y / t1 2 1 2 一2 0 0 6 表3 马铃薯脱毒种共田间检验原始数据记录表 品种 名 称 品种 编 号 受检单位 联系电话 检验地点省县乡村 检验时间 检验类别检验依据 样品数量代表面积az 物俨 种薯来源 有无摄像照片 田间栽培管理经过: 气 每点 检 验 株 数 混 杂 株 数 病毒病株数真、细菌病害病株数 类病 毒病 株 数 花 叶卷 叶 条 斑 坏 死 黑 胫青枯环腐癌肿 illlll1ll1n1llillillilllh ill l 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 总计 混杂及 病 株 百 分率 ( % ) 两 次 重 复 合计或 平 均 备注 检验人:校核人:甲核人: 1 1 . 3 . 1 自 繁自 用种薯，由 繁种单位自 检， 将检验记录报检验部门备案， 需要复检时，由 检验部门 派 人复核检验。出 售种苗、 种薯由 专职机构和种子部门进行检验， 签发检验报告。 1 1 . 4 判定规则 11. 4 . 1 脱毒种薯分级以 脱毒种薯繁殖田 所播种的 级别， 带病植株比 率和混杂植株比 率为定级标准。 11. 4 . 2 各级别脱毒种薯的 带病毒病株率， 黑胫病和青枯病株率以及混杂植株比 率三项指标，任何一 项不符合原来级别所定质量标准，但又高于下一级别质量标准者，判定结果按降低一个级别定级。 nv/ t 1 2 1 2 一2 0 0 6 1 1 . 4 . 3 种薯检验合格证 马铃薯脱毒种薯检验合格证 马铃薯 脱毒种薯质量检验合格证书 年月日编号 : 种薯 生产单位 全称 :省县村 ( 单位 )联系 方式 : 种薯级别:品种名称 :重量k g 经按中华 人 民 共 和国马铃 薯 脱 毒种薯 c b/ t xx x x x 质量标 准检 验合格 。 检 验 人 :( 签字 ) 检验单位:( 印章) 联系 方式 : 12包装、标签 1 2 . 1 包装 1 2 . 1 . 1 用通气良好清洁卫生的材料。 12. 1 . 2 标准袋净重35晚，内 装标签。 1 3 标签 13. 1 标签选择韧性大、防雨防潮，不易涂改的材料制作。 13. 2 颜色 原原种为白色、一级原种为绿色、 二级原种为黄色。 1 3 . 3 标签用蓝色圆珠笔填写，不得空项。 13. 4 标签平展正面置于扎口处。 13. 5 标签设计 8 0n l l n o 马铃 薯 沮 兑 毒种薯 种薯 级别 品种 名称 合格 证书 编号 生产单 位 地址 联系方 式 验 收 人 n丫 / t1 2 1 2 一2 q 0 6 附录a ( 规范性附录) 酶联免疫吸附试验法 e l l z y n 肥 一 li nkedl lnln unosor比 1 1 t a s s ay) 应用双抗体夹心法 ( d u 】 le anti 1) 泪 y s u l d 俪chm e t l l x l ) 检测马铃薯脱毒苗是否带有p 、 仪 、p 、 7 y 、 p v s 、 p l r v等主 要马铃 薯病毒。 al 仪器和设备 a ! . 1 聚乙 烯微量滴定板: 40孔和%孔，均可 使用。 al. 2 微量可调进样器: 需2 胖 l 一1 0 拜 l 、1 0 拼 l 一 50胖 l 和 1 0 拜 l 一 2 00拜 l 三种规格， 并附相应规格 的塑料头。 a ! . 3 冰箱。 a l . 4 保温箱:温度设置为 37。 al . 5 直径 s ctn 的瓷研钵及钵锤。 a l . 6 酶联免疫检测仪: 检测辣根过氧化物酶 ( hors e 拍 di shpeoid as e . h r p )标记的 酶标记抗体用 490 nln ， 波长检测， 碱性磷酸 ( 月kali 、p 腼p hata sea k 卫 ) 标记的酶标抗体用4 05nrn 波长检测。 a z 应用的化学试剂 所用为分析纯级规格、用水为蒸馏水。 a z . 1抗体免疫球蛋白 ( r g k 刃 u h n) 和酶标记抗体 ( 为 n iu g a te ) : 从某一马铃薯病毒抗血清提 取的免 疫球蛋白， 将其浓度调为l mg/ i l l l ， 做为包被微量滴定板的抗体。用辣根过氧化物酶标记的某一病毒 的 免疫球蛋白的 酶标记抗 体、 浓度为1 : 1 0 00以上， 贮藏条件为4 。 a z ， 2 碳酸盐包被缓冲液: p hg. 6 ，1 . 59g n a c q ( 碳酸钠) ， 2 . 93g n a h c o 3( 碳酸氢钠) 加水至1 l。 a z . 3 p 粥 一i we e n20缓冲液，p 印 . 4 ， s g n a c i ( 氯化钠)0 . z g k 峡p o4 ( 磷酸二氢钾) 、2 . 2 9 n az 】 】 p ( ) 4 . 7 玫0 ( 磷酸氢二钠) 或2 . 9 叨az h p ( ) 月 . 12 玩0 ， 0 . z g k c i ( 氯化钾)加水至i l ， 然后加 0 . 5 1 刀 l t w e e n 20， 洗涤微量滴定板用。 a z . 4 样品 缓冲 液: 取p b s t w ee n 一 20缓冲液l ooll l l ， 加聚乙烯毗咯 烧酮 ( p 、 甲 )2 90 a z . 5 底物缓冲 液: 取0 . 2 n lo 1 几n az hp q 12氏0溶液25. 7 了 i il 力 目 。l mo工 几柠檬酸溶液24. 3 n 1 l 力 日 水50m l ， p h调至5 . 0( 现用现配) 临用前加磷苯二胺40mg，30% 践0 ，( 过氧化氢) 0 . 巧m l 混 匀， 避光放置。 应为白 色或微黄色溶液。 a z . 6 终止液:为0 . 2 1 n o 1 几 硫酸溶液，用 1 体积浓硫酸加 9 份水。 a3 操作步骤 a 3 . 1 包被微量滴定板:把免疫球蛋白用包被缓冲液按 1 : 1 0 00 稀释，用微量进样器向微量滴定板的 每一样品孔内加人稀释的 免疫球蛋白2 00拜 l 。 在37条件孵育l h( 或在4 条件下过 夜) 。 a3 . 2 洗涤包被的微量滴定板:甩掉微量滴定板中的免疫球蛋白稀释液，再在吸水纸上敲打微量滴 定板，除尽残留溶液。向微量滴定板的样品孔中加满洗涤缓冲液， 停留30 min，甩掉洗涤缓冲液，共 洗涤 3次，以除尽未吸附的免疫球蛋白。 n y / t 1 2 1 2 一2 0 0 6 a 3 . 3 加被检测的样品 a 3 . 3 . 1取样:在 无菌条件下， 从瓶苗上剪下长2 二 茎段， 放在小研钵内， 把取样的 试管苗放回原 瓶内，封好瓶 口，把样品编好号，以便检测结果决定取舍。 a 3 . 3 . 2 向 小研钵内加样品 缓冲液， 加人液量依每个样品上样的孔数而定， 例如每个样品准备上样 一个样品 孔时， 可 加人0 . 4 m l 样品 缓冲液， 研磨后可得2 00拜 l 清液， 够上一个样品 孔用。 a3 . 3 . 3 加人检测样品:向编好号、洗涤完的微量滴定板的样品孔内，按样品编号、逐个加人提取 的 样品 液2 00拜 l ，每一 块微量 滴定板上， 可 设两个阳性对照 孔。两个阴 性对照孔和两 个空白 对照 孔。 a3 . 3 . 4 把加完样品的微量滴定板，在37条件下孵育 4 h 一6 h( 或在 40条件下过夜) ，然后按a 3 . 2 洗涤 微量滴定板。 a 3 . 3 . 5 加酶标记抗体: 把酶标记抗体用样品缓冲液按11 0 00稀释， 向每个 样品 孔中加人2 00肛 l 稀 释的酶标记抗体。 a 3 . 3 . 6 洗涤微量滴定板: 按3 : 2 方法洗涤微量滴定板，以除 掉未结合的 酶标记抗体。 a 3 . 3 . 7 加底物: 使用国 产酶标检测仪器测定光密度时，向 每一样品孔内加底物缓冲液1 00拜 l 。 如 果用进口bi o r ad5 50 型 等进口 酶标检测仪时则可加人2 00拌 l 底物，当 观察到阴 性对照孔与阳 性对照 孔显现的颜色可以明确区分时 ( 辣根过氧化物酶标记的酶标记抗体显现橘红色，碱性磷酸酶标记的抗 体显现鲜黄色) ;或未设对照样品孔的微量滴定板的一些样品孔之间显现的颜色可以明确区分时，每 孔 加 人30拜 l 终 止 液， 如 加 人2 00拜 l 底物 缓 冲 液 时 则 加 人50拜 l 终止 液 ( 碱 性 磷酸 酶 标 记的 抗 体 一 般 可不加终止液) 。 a 4 结果判定 a 4 . 1 目 测观察: 显现颜色的深浅与病毒相对浓度呈正比 。显现白 色为阴性反应， 记录为 现淡橘红色即为阳性反应， 记录为 “ + ” ， 依颜色的 逐渐加深记录为 “ + ” 和 “ + ” 。 a 4 . 2 用酶联检 测仪 测定光密度值: 样品 孔的光密度值大于阴 性对照孔光密度值的2 倍、 阳性反 应 ( 阴性对照 孔的光密度值 应镇 0 . 1)。 a s 计算结果: 即判定为 1 = 兰x 1 0 0 % 式中: 1 马铃薯病毒检出率， %; m呈阳性反应样品数量; 二 实验室样品数量。 结果用两次重复的算术平均值表示，脱毒苗病毒检出率修约间隔为并标明经舍进或未舍未 ny /t 1 2 1 2 一2 0 0 6 附录b ( 规范性附录) 往复双向聚丙烯酞胺凝胶电泳法 ( 1 切 。 一 di men si onalp 0 l y a c ry l ainide gei el ec trop ho哪15) 应用本法检测 脱毒苗是否感染有马铃薯纺 锤块茎类病毒。 bl 范围 规定了马铃薯 纺锤块茎类病 毒 ( p stv d) 的检测方法。 适于检测马铃 薯纺 锤块茎类 病毒。 b z 引用标准 ( ; b1 8 1 3 3 一2 0 00马铃薯 脱毒种薯 n y /t 4 01一2 0 00 脱毒马 铃薯种薯 ( 苗) 病毒检测技术规程 ( 检测方法引用n y / t4 01一2 0 0 0) b3原理 类病毒分子在 自 然和变性条件下电泳迁移率不同，变性所引起类病毒核酸的环状结构使其电泳迁 移率明显慢于 祯分子量的 其他线性 r n a分子， 因而第二向电 泳中类病毒核酸的环状结构明显滞后， 据此，结合可靠灵敏的银染色技术测定类病毒。 b4试剂 本方法所用化 学试剂为分析 纯极规格， 用 水为 蒸馏水，个 别要 求无菌 水。 b 4 . 1 盐酸 溶液 甲 ( h c i )= 1 + 4 量取盐酸1 0 i l ll ， 加人4 0 m l 水， 混匀。 b 4 . 2 核 酸 提 取 缓冲 液 助 ( 。犯 明) 3 c n h3= 1 2 1 1 9 l 一 ， 尸( q o h 1 4 姚氏 n 处 2 玩。 )= 3 . 7 2 9 l 一 ， 可nacl )= 5 88gl 一 称取三经甲 基氨基甲 烷 ( c h 2 0 i i ) 3 c n 玩 12. ng ， 乙二胺四乙酸 二 钠 ( 场 。 h :; 从氏n 处 . 2 眺0 )37 2 9 ， 氯化钠 ( n a ci)5 . 5 8 9 溶于g o o m l 水中， 用盐酸溶液 ( 4 . 1 ) 通过酸度计 ( 5 . 1 ) 调p h为9 . 0 一 9 . 5 ， 定容至1 0 0 0 m l 。 b 4 . 3 1 ， a e 缓冲 液 贮 液 助 ( 。犯 以1 ) 3 c n l l 3 = 4 8 . 4 6 9 l 一 ， 夕( c h 3 c 。 n a )= 1 6 . 4 0 9 l 一 ， 户 ( q 0h14 n 2 味n a22 践0) = 7 . 44gl 一 称取三经甲 基氨基甲 烷 以c h 2 0 i i ) 3 cn比 48. 469 ，无水 乙 酸钠 ( c h 3 c ( x n a )1 6 . 4 0 9 ， 乙二胺四 乙酸二钠 ( c l o h i ; 姚氏n 处 2 眺。 ) 7 . 4 4 9 ， 溶于9 0 0 rn l 水 中， 用冰乙 酸通过酸度计 (5. 4) 调p h为8 . 1 ， 定容至1 0 00m lo b4. 4 t 月 三 缓冲 液 工 作 液 川( c h z o h ) 3 !n h a3 = 4 . 85g l 一 ， 尸( c h 3 o ) n a) = 1 ， 64g l 一 ， p ( qo h ， 4 n 2 味n 匆 2 钱0)二 0 . 7 4 9 l 一 量取t a 卫缓冲 液贮液 ( 4 . 3 ) 2 0 o m l ， 加水1 5 0 0 1 1 止 q b 4 . stbe 电 泳 缓 冲 液 贮 液 川( c 日 2 0 h ) 3 cn线= 1 07 8 g l 一 ， 户( 玩b o 3 )= 550 gl 一 ， p ( ci o h14 从场n a2 2 玩0) 二 9 ， 3 gl 一 称取三经甲基氨基甲烷 【 ( c 日 2 o h ) 3 cn玩了1 07. 8 9 ， 硼酸 ( 践日 飞)5 5 ， 0 9 ，乙 二胺四乙酸二钠 ( q o h14 姚氏n 匆 2 践0 )9 . 3 9 溶于少量水中， 定容至1 0 00 rn lo b 4 . 6 j rb e 电 泳 缓冲 液 工 作 液 川( 。 2 0 1 1 ) 3 cn践= 10. 78g l 一 ， p( 玩 工 ， 几 )= 5 . 50g l 一 ， 尸 ( c ， 。 h ，。 从味n 处 2 眺0 )= 0 ， 9 3 9 l 一 量取变性电 泳缓冲 液贮液 ( 4 . 5 )2 0 0 1刀 l ，加 水1 8 0 0 m l o 低盐溶液 助 ( n aci )= 1 1 . 7 9 l 一 称取9 . 3 5 9 氧化钠 ( n aci ) 溶于s o o n il i 人 e 缓冲 液工 ( 4 . 4 )中，0 . i mp a 灭菌3 0 min 。 ny/ t 1 21 2 一2 0 0 6 b 4 . 8 高 盐 溶 液峥 ( n aci)= 8 7 . 7 5 9 l 一 称取 氧 化 钠 ( n a ci ) 7 0 . 1 3 9 ， 溶 于8 0 o n il 了 r a e 缓冲 液工作液 ( 4 . 4 )中， 0 . i mp a 灭菌3 0 rn in 。 b4 9 丙 烯 酞 胺 贮 液 杯c h z 一 chcon h z ) 一 2 90 . 0 g l 一 ， *( c h z 二 c h c ) n h z ) 2 ! h z = l0gl 一 称取丙烯酞胺 ( 口卜 = 口ic ( n 践)29. 0 9 ，甲 叉双丙 烯酞胺 ( c l l z = ch c o n 践) z c l l z 1 9 ， 37溶 于1 00m l 水中。 冰箱冷藏室 ( 5 . 1 3) 保存。 b4. 10 过 硫 酸 钱 溶 液 川( n 玫) 2 岛 味 = 2 222 gl 一 称取 过 硫酸 馁 ( n 玩) 2 昆 味) 1 . o 9 ， 溶于 4 . s m l 灭菌水中，冰 箱冷藏室 ( 5 . 1 3) 保存。 b 41 1 四甲基乙 二胺 以 毛 n汇日 2 ) z n ci 毛 。 b 4 . 12 核酸固定液 【 。 ( 。b c h z o h )=10%，。 ( 口卜 0 ) 卫 1 )=0 . 5 % 量取50n il 月 5 %乙醇 ( c h 3 c h z o h ) ; 2 . s m l 冰乙酸 ( c h 3 c ( x h )加水定容至5 00m lo b4. 13 染色 液睁 ( 掩n o 3 )= 2 . 0 g l 一 称 取1 . 0 9 硝 酸 银 ( 掩n o 3 ) 溶 于 水， 定容 至5 00ml 。 b 4 . 1 4核 酸 显 影 液 助 ( n 以 h )= 1 6 9 l 一 ， 。( h c h 。 )= 0 . 4 % 称 取8 9 氢 氧化 钠 ( n 以 川) ， 溶于 5 00 1 l l l水中，用前加21l l l甲醛 ( hc h ) ，现用现配。 b 4 . 1 5增 色 液 助 ( h 匆 。 飞 ) = 7 . 5 9 l 一 取3 9 碳 酸 钠 ( h 匆 。 飞 ) ， 溶 于4 o o m l 水 中 。 b4. 16 指 示 剂 尸( 电氏 7 姚 n “ 巧 昆 ) 二 1 . o gl 一 ， p( q g h1 0 铸 brs) = 1 . 0 gl 一 ， p( q z 氏 z q ， ) = 0 . 4 9 l 一 称取1 0 0 雌 二甲 苯兰 ( qs 践7 n z n a q凡 ) 、1 0 0 毗 嗅酚蓝 ( q g h i 。 味b 介 5 ) 、 4 0 9 蔗糖 ( q z 践2 011 ) ， 溶于101l l l t b e电 泳缓冲液贮液 ( 4 . 5) 中， 然后加人90m l 水， 混匀。 b 4 . 17 琼脂糖溶液 称取1 9 琼脂糖， 量取10m l t 日 e电 泳缓冲 液贮液 ( 4 . 5)， 加人90m l 灭菌水 中，加热溶解。 b 4 . 18聚丙烯酞胺凝胶量取丙烯酞胺贮液 ( 4 . 9) 8 . 3 ml ，们3 e电泳缓冲液贮液 ( 4 . 5) 5 n 1 l ，四 甲 基乙二胺 ( 4 . 11)50拜 l 一 60 拼 l ， 溶解并用无菌水定容至 50m l 混匀， 灌胶前加过硫酸胺溶液 (4. 10) 450 拌 l ， 混匀， 立即灌胶， 此液应现配现用。 b s 仪器设备 b s . i d 、 马r- lll6 b电泳仪和d 、 飞几 ill28c电泳槽。 b s . 2 丁 ul 一 1 6 g高速台式离心机最高转速:210 00 r 加i no b s . 3 si gma 3 k 30高速冷冻离心机 控制范围:( 一 加一 4 0)， 最大转速: 300 00r 加i no b s . 4 p h s- 3 c 酸 度计量程: p h( 0 一 1 4 ) ， 精度:士 0 . 0 1 p h 。 b s . s d l-101 一 2 5电热鼓风干燥箱量程:r.t十20一300 ，精度 :士1 。 b s . 6 移液 器 2 0 拜 l ， 4 0 拜 l ， 2 0 0 拜 l ， 1 0 0 0 拌 l 。 b s . 7 7 5 2w紫外分光光度计量程2 20 二 一8 00 nm ，精度:士z n m b s . 8 一次 性注射器s rn l ， 5 0 rn l 。 b s . 9 量筒5 0 ml ，1 0 0 ml ，z o 0rnl ，2 0 0 0 ml 。 b s . 1 0 容量瓶5 0n ll，1 0 0 m l，5 0 0m l 。 b 51 1 吸量管 s m l ，1 0 m l ， 2 0 m l 。 b s . 1 2 m】 ) f es u3 3 2 低温保存箱。 b s . 1 3 13 c i 卜 2 6 1 冰箱。 b 6 试剂制备 b 6 . 1 样品粗提液制备 取样品 ( 脱毒苗、薯块的 薯肉)3 9 左右放人干燥的研钵中， 加人液氮进行研磨。 研碎后向小研 钵中 加入101 n l 核酸提取缓冲液 ( 4 . 2)， 5 略粉 ( 十二烷基磺酸钠) 约0 . 1 9 、 皂土约0 . 1 9 ， 再研磨 6 rn i n 一1 0 m i n 。向 小研钵中 加人1 2 0 “ l 价琉基乙醇， 再研磨6 m i n 一l o m i n 。 加人1 1 n 1 l苯酚。研磨 1 1 n、/ t 1 2 1 2 一2 0 0 6 6 m i n 一1 0 tn i n 。 加人1 2 n 1 l氯 仿， 再研磨6 m i n 一1 0 m i n 。 将研好的 样倒人5 0 rn l 千净的离心管中， 用氯仿平衡。 高速冷 冻离心 机 ( 5 . 3) 4 、 9 0 00r 而in 一 10o 00r/m 讯离心20m ln 一 25 m in ， 用移液 器 ( 5 . 6)， 将上层水相 ( 样品 粗提液) 转移到另一清洁的 离心管中， 可现用， 也可冻存 ( 一 20) 。 b 6 . 2 核酸纯化 将6 . 1 中 有上清液的离 心管拿出 备用。 在 1 00m l 无菌水中加人一定量的 可溶性纤维素， 混匀备 用 。 装柱: 用带孔的 橡皮塞和 细纱装人s m l 的一次性注射器 ( 5 . 8)， 向注射器中 加纤维素液， 直至 纤维素沉积至 3 . s ml左右处，期间要不断加人无菌水。 上样: 将上清液缓慢加人到柱中， 直到加完为止。 用低盐溶液 ( 47) 洗脱， 每次加人2 1 1 止， 共 20次约40m l 。 待柱中 低盐将流 尽时， 加人l m l高盐溶液 ( 4 . 8) 进行清洗， 然后将50m l 干净离 心管置于柱下分 4 次 ( 每次2 1 l l l )加人8 1 1 止高盐溶液 ( 48)，待高盐洗液全部流人50 n 1 l离心管为 止。向装有高盐洗液的50m i j 离心管中 加人冻存的95% 乙醇， 加人量是离心管中液体的3 倍左右， 摇匀， 放人低温保存箱 ( 5 . 1 2) 一 20以 下冷冻， 时间 不得少于z ho b 6 . 3 总核酸提取 将冻存的离心管拿出 来， 用95% 的乙醇平衡， 然后用高速冷冻离心机 ( 5 . 3) 1 一 4 、1 0 0 00 r /m in离心20 min，倒掉上清液，将离心管倒立放在铺好的干净滤纸上。待水分吸干后，向离心管中 加75%的乙醇， 加人量是离心管容积的1 乃， 进行清洗，时间为10m in 一 20m in 。 用75%乙 醇平衡， 用高速冷冻离心机 ( 5 . 3) 1 一 4 、100 0or /min离心10m in ， 倒掉乙 醇， 将剩余乙 醇全部挥发掉。 b 6 . 4 试样获得 将t 闰乙 缓冲液工 作液 (4. 4 ) 2 00拌 l 加人到盛有总核酸的5011 止离心管中进行溶解，然后用移 液器 (5 6) 将其移到1 . 5 1 1止干净的离心管中， 再次用2 00 拌 l t a e 缓冲液工作液 (4. 4) 进行清洗， 将清洗液全部转移到 1 . s n 止 离心管中。 b 7 测定步骤 b7 . 1 试料 将盛有试样 ( 6 . 4) 的 离心 管在漩涡混合器上振混匀， 然后用高速台 式离心机 ( 5 . 2) 4 0 00r /min 离心3 m i n 一s m in o 然后量取1 5 拜 l 样品， 用3 o 00拜 l l ，川二 缓冲 液工作液 (4. 4) 稀释，以 不加样品的t a e 缓冲 液工 作液 ( 44) 为空白对照。紫外分光光度计 ( 5 ， 7) 260 nln 处，测定各试样光吸收值。 夕 ( r n a ) 小9 仁 l 一 = a2 6 1、 x2 0 1 0. 0 2 5 又 10 0 0 = 8 . 0 4 a2 印 一般电泳加样试料的 r n a质量 ( 跳: b7 . 2 测定 b7 . 2 . 1 制板 取洁净电 泳槽， 琼脂糖溶液 ( 4 . 1 7) 道。 b7 . 2 . 2 加样 按7 . 1 中 计算试牢 架 体积，混 入指 示剂 b7. 2. 3正向电泳 要求相对一致， 据v = 鱼， 计算试料体积 ( v ) 封底，注人聚丙烯酞胺凝胶 ( 4 . 1 8 ) ，反加样梳插入做成泳 ( 4 . 16)和t b e 缓冲 工作液 ( 4 . 6)， 总量为40拌 l 一 6 0 产 lo 加人 1 丑 e电泳缓冲液工作液 ( 4 . 6)，进行从负极到正极电泳，电泳仪 ( 51) 电压调到 1 50 v。 当 示踪染料二甲 苯兰迁移到 距凝胶底部i cm一z c m时，停止正向电泳。将电泳槽中缓冲液倒掉， 把 电泳槽置人电热鼓风干燥箱 ( 5 ， 5) 中75预热 30 而n 。然后向电泳槽中加人 75的 丁 b e缓冲液工 作液 ( 4 . 6 )变性1 5 m i n 。 b 7 . 2 . 4 反向电泳 l 2 ny/ t 1 21 2 一2 0 0 6 在电 热鼓风干燥箱 ( 5 . 5) 中进行 从正极到负极的反向电泳， 电泳仪 ( 51) 电压调至2 00v ，当 二甲苯蓝示踪染料带迁移到胶板上方刚跑出水面时停止电泳，取出凝胶片进行染色。 b 7 . 2 . 5 固定 把凝胶片放在置有4 001l l l 核酸固定液 (4. 1 2) 的培养皿中， 轻轻振荡10m in ，固 定0 . s h 一l h ， 然后用 501 l l l注射器 ( 5 . 8) 吸净固定液。 b 7 . 26 染色 向培养皿中加人 4 0 0 i n l染色液 ( 41 3 ) ，轻轻振荡1 0 m i n ，染色3 0 rni n一4 0 rn i n ，然后吸出染色 液 ( 可重复使用) 。 b 7 . 2 . 7 漂洗 用蒸馏水清洗凝胶板，以 除掉残留的 染色体， 共冲 洗四 次， 每次用水4 00m l ， 每次冲洗1 5 : 。 b 7 . 2 . 8 显影 加人核酸显影液 ( 4 . 1 4) 4 00m l ， 轻轻摇荡， 直到核酸带显现清楚为止。 b7 . 2 . 9 增色 吸出显影液，加人增色液 ( 4 . 1 5) 4 00 n 止，增色 5 而n 。吸掉增色液拍照。 b s 计算结果 与阳性对照相同位置有谱带出现者为阳性。 式中: 9 马 铃薯纺锤 块茎类病毒 k 呈阳性反应样品数量; 了 实验室样品数量。 9 一 手 x 1 0” % ) 检出率， %; 结果用两次重复的算术平均值表示，修约间隔为 1 ，并标明经舍进或未舍未进。 阳性对照 ( p s ，vd 的r na )泳道下方约 1 /4处应有拖后的黑色核酸带。 bg 判定 采用全数值比较法 ，标准规定各级别种薯马铃薯纺锤块茎类病毒 ( p s j i ， v i )允许率应为零，检出 变大于零。或经舍弃为零者均不合格。 n y / t 1 2 1 2 一2 0 0 6 附录c 规范性附录) 马铃，环腐病检测方法 用格兰氏 染色和茄子接种鉴定法结合起来鉴定马铃薯苗 和脱毒种薯是否感染马铃薯环腐病。当用 格兰氏染色鉴定为阳 性结果时， 再用茄苗接种鉴定法进行鉴定， 也产生阳 性结果时， 才能确认是马铃 薯环腐病菌。 cl 格兰氏染色 ( c r a ns t a i n ) cl . 1 试验设备 cl . 1 . 1 显微镜 cl . 1 . 2 载玻片 cl . 1 . 3 酒精灯 c l . 2 试剂: 所用试剂为 分析纯级， 用水为蒸馏水， 个别为无菌水。 c l . 2 . 1 龙胆紫染色液: 2 . 5 9 龙胆紫加水到i lo c 12 . 2 碳酸氢钠溶液: 12. 5 酬a h q沁( 碳酸氢钠) 加水到i lo c l . 2 . 3 碘媒染液: 2 9 碘溶解于10m l i m n a o 日( 氢氧化钠) 溶液中， 加水定溶为 1 00 m lo c l . 2 . 4 脱色剂: 7 5 m l95 %乙 醇加2 5 m l 丙酮。 c l . 2 . 5 碳性品 红复 染液: 取 1 00m l 碱性品红95% 乙醇饱和液， 加水到i lo cl . 3 取样制备涂片: 所有 试验用具 都要用70% 酒精擦拭灭菌。 cl . 3 . 1 鉴定植株:从地表上方z cm 处割断，用镊子从切口挤出汁液，滴 1 滴于载玻片上，风干后， 用酒精灯火焰烘烤2 次一3 次固 定。另一方法是， 从切口一端切下0 . s cm 厚茎片，在小研钵中 研磨， 吸取1 滴汁液 滴于载玻片上， 风干， 用酒精灯火焰烘烤2 次一3 次固 定。 c l . 3 . 2 鉴定块茎:切开块茎， 如维管束 处有菌脓或渗出 物，用 镊子 压挤， 滴1 滴于 载玻片上，加1 滴无菌 水稀释， 风干后， 用火焰烘烤2 次一 3 次固 定。 如无渗出 物，用镊子从维管束附近取出一些碎 组织 放在载玻片上， 加 1 滴无菌水， 移掉碎组织。风干 后， 用 火焰烘烤2 次一 3 次固定。 cl . 4 涂片染色 c l . 4 . 1 滴1 滴龙胆紫与碳酸氢钠的等量混合液 ( 现用现配)于载玻片上， 染色2050 c l . 4 . 2 滴1 滴碘媒染液媒染20、 ， 滴水洗涤。 cl . 4 . 3 滴 1 滴脱色剂 ，脱色55 一10 5 ，滴水洗涤。 c l . 44 滴1 滴碱性品红溶液复染2 5 一 3 。 ， 滴水洗涤， 风干。 c l . 5 镜检和 结果 判定: 用1 0 00倍一1 5 00倍显 微镜镜检， 如见到呈蓝紫色的 单个细菌或集聚为2 、 3 或4 个细菌， 判定为阳 性反应; 染成粉红的 判定为阴 性反应。 c z 茄子接种鉴定法 c z . 1 寄主植 物准 备: 一般常用 “ 黑美人”( bl a ckbe出 t y )品 种。先在 大花盆中育苗，出 苗后移植到 装有营养土的花盆内， 每盆1 株。当 茄子苗长到2 周一 3 周出 现第三片真叶 时即 可用于接种鉴定。 c z . 2 接种体制备: 按c1 3 ， 1 与cl. 3 . 2 方法制备接 种体， 加适 量无菌 水稀释。 c z . 3 接种方 法: 用 l m l 卡介苗注射器吸 人制备好的 接种体， 用4 号针头， 在茄苗真叶与子叶之间 的茎部作针刺接种， 每株茄苗针刺3 个