浙江大学生物化学实验甲质粒DNA的小批量提取与鉴定.ppt

质粒DNA的提取与电泳鉴定,1、质粒简介 质粒是一种寄生性的自主复制子，存在于细菌等细胞中，为双链闭环的DNA分子，大小为1kb200kb之间，具有自主复制和转录的能力，但其复制和转录要利用宿主细胞（细菌）编码的一些酶和蛋白质。 2、分离纯化质粒的原理 分离纯化质粒DNA主要是利用宿主染色质DNA与质粒DNA之间的差异来进行的。,质粒DNA的提取与电泳鉴定,细菌DNA与质粒DNA形状上均为双链环形，但二者的分子量相差较大，细菌DNA的分子量在109D左右，而质粒DNA的分子量仅为106 107D， 提取纯化质粒的过程中，细菌DNA大多断裂成线状分子，而质粒DNA则多数仍为双链环状，从而即可将二者分开。 本试验采用微量碱变性法来分离纯化质粒DNA，具体的分离纯化原理如下：,0,质粒DNA的提取与电泳鉴定,质粒DNA的天然结构为共价闭环（超螺旋）结构，但在制备过程中，由于各种因素的影响，同一质粒DNA的分子可能呈现出如下几种构型： 超螺旋型（共价闭环）质粒DNA：（cccDNA）超螺旋状。 开环质粒DNA：（ocDNA）质粒DNA的两条链中有一条链发生一处或多处断裂，从而形成松弛的环状分子。 线状质粒DNA：（linearDNA）质粒DNA的两条链在同一处断裂，从而变为线状分子。,质粒DNA的提取与电泳鉴定,电泳时，由于分子形状的不同，三种质粒DNA的泳动行为不同，根据电泳迁移率从小到大的顺序分别为开环质粒DNA、线状质粒DNA和超螺旋质粒DNA。 3、DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定原理 核酸是一种两性电解质（碱基、磷酸），在pH8.0下，核酸带负电荷，电泳时向正极移动，根据核酸分子所带电荷的多少，分子的大小及构型的差异，可用电泳的方法对核酸进行分离和鉴定。,质粒DNA的提取与电泳鉴定,电泳中所使用的支持介质有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶，核酸中常用琼脂糖凝胶。 不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离200bp50kb的DNA片断，通过在琼脂糖溶液中加入低浓度的莹光染料溴乙锭（EB），在紫外光下即可检测出10ng的DNA条带。 当用琼脂糖凝胶电泳法检测质粒DNA样品时，根据条带的位置即可知道质粒分子的三种构型及其比例，,质粒DNA的提取与电泳鉴定,此外，还可了解质粒样品中的杂质，如RNA、染色体DNA、蛋白质等的污染程度。电泳时如用已知分子量的核酸作对照，还可测定样品核酸的分子量。 4、材料与试剂 、试验材料 含有pUC系列、PSK等高拷贝质粒的菌株。 、试验试剂 试验试剂及使用时的注意事项解说详见P144及P147。,质粒DNA的提取与电泳鉴定,5、操作步骤 、质粒的提取 质粒提取的操作方法及注意事项解说详见P145。 、电泳鉴定 胶浓度：0.7% 各步操作方法及注意事项解说详见P148。 6、实验结果及处理 仔细观察纯化过程中各步试验现象。 仔细观察电泳后荧光带的显示情况，据此绘制电泳图谱并对图谱进行简要说明。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,1、限制性内切酶简介 限制性内切酶或限制性核酸内切酶（Restriction Enzyme or Restriction Endonuclease）是指能辨认双螺旋DNA分子中的特异碱基序列，并在此特异位点处以内切方式将双链DNA切断的一类酶。 根据它们的作用特点，可将其分为三类：类和类酶，在同一种酶分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用，类酶由于切割位点随机，类酶则由于切割位点不对称，因此这两类酶的作用都不大。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,类酶由两种酶组成，一种为限制性核酸内切酶，另一种为独立的甲基化酶。其中，对我们最为有用的是类酶中的限制性核酸内切酶。 限制性核酸内切酶广泛存在于原核生物中，1968年由Meselen和Yuan从大肠杆菌中第一次分离得到，现已发现近几百种(498种)。 该类酶能识别DNA分子中的特异序列，并在此序列处切断DNA双链。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,绝大多数限制性内切酶的识别序列为4个6个碱基对，该序列具回文对称结构，且富含GC。（即旋转1800后与原来结构相同），少数酶可识别更长的序列或兼并序列。 限制性内切酶切割后的DNA片断，有的产生粘性末端，有的产生平末端。如： 、产生粘末端的酶,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,BamH：G G A T T C C Hind：A A G C T T C C T A A G G T T C G A A 两条链的断裂位置是交错地担又对称地围绕着一个对称轴排列。 、产生平末端的酶： Hae：G G C C C C G G 两条链的断裂位置处在一个对称结构的中心。常用限制性内切酶的酶切位点可参见有关书藉。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,限制性内切酶由于能识别特异顺序并进行切割，因而在基因重组、序列分析、基因组甲基化分析及基因物理图谱的绘制等技术中被广泛应用。 2、质粒pUC19的酶切图谱 质粒pUC19的酶切图谱见图1.2。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,由图可见，实验所用的BamH和Hind在质粒pUC19上均为单切点的限制性内切酶， pUC19经这两种酶切割后可产生大小二片段，大片段为2.656bp，小片段为30bp。如为完全酶切，电泳后应产生这两个片段的电泳图谱，由此即可对提取的质粒进行鉴定。 3、影响限制性酶切反应的因素 DNA纯度、缓冲液、温度及限制酶本身都会影响酶的活性。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,为避免污染，每次吸取限制酶时都需用新的吸管头。 应注意，如采用两种限制酶进行切割，则必须分别提供各自的最适盐浓度。 若两者可用同种缓冲液，则可同时水解，否则低盐浓度的限制酶必须先用，待调节盐浓度后，再用高盐浓度的限制酶水解。 也可在第一个酶切反应完成后，将