两种方法检测hbsag假阳性和假阴性影响因素的探讨

1 / 6 两种方法检测 HBsAg 假阳性和假阴性影响因素的探讨 目前 HBsAg 的检测方法很多，但是在临床实验室检测HBsAg 的方法最常用的主要是金标法和酶联免疫吸附试验（ ELISA）。含 HBsAg 在内的乙肝两对半检测结果对升学、就业等都有着重大的影响，常常会有患者及其他工作人员反映HBsAg 检验结果与其他医疗单位不一致，为此常会发生医疗纠纷。因此，提高 HBsAg 检测的准确性，避免假阳性和假阴性所造成的不良社会影响，是我们临床检验工作者应该重视的问题。 为了减少 HBsAg 检测出现假阳性和假阴性，我们有必要对 这种现象的原因进行分析，在实际的检测工作中，造成HBsAg 检测出现假阳性和假阴性主要受以下因素影响，分述如下： 金标法假阴性原因 1.1 检测时间短 ,金标法最适判读时间为 1530 分钟 ,若时间太短就会发生一些弱阳性 HBsAg 标本出现假阴性。 1.2 灵敏度较低，金标法 1ng/ml,而 ELISA 法 1ng/ml也能检出。 1.3 层析过快， HBsAg-Ab1-Au 还没来得及与 b2 结合就越过了检测线，这就可能造成假阴性结果。 2 / 6 1.4 后带现象，即 HBsAg 的钩状效应。不管是 ELISA法还是金标法，因反应原理均为 “ 一步法 ” ，所以当标本中HBsAg 强阳性时两者均可出现后带现象，检验结果反而出现假阴性。 1.5 个别标本可能存在 HBsAg 亚型差异而不易检出。 金标法假阳性原因 2.1 溶血或红细胞的标本，有时会在检测区出现一条颜色很浅的非特异型层析线，由于金标法主要是通过目视法判定结果，所以常会误认为假阳性，应该引起重视。 2.2 为预防乙肝，部分 HBsAg 阴性人群在接种乙肝疫苗的 12 周内，血清中有时可检出 HBsAg 弱阳性，形成一过性 HBsAg 阳性，这 可能是乙肝疫苗主要成分是 HBsAg。建议接种乙肝疫苗后个月内不应做 HBsAg 检测。笔者曾多次发现此类因为注射乙肝疫苗出现的假阳性问题，但用 ELISA 一步法检测仍为阴性即可消除上述干扰，其机理尚未十分清楚。 2.3 汉坦病毒会造成 HBsAg 金标法检测假阳性，可能是汉坦病毒与 HBsAg 存在交叉性，易造成假阳性结果。 3 ELISA 法假阴性原因 .1 标本用肝素或 EDTA 等抗凝处理易造成 HBsAg 检测结果假阴性，肝素抗凝血浆会增加 D 值 ,可能与高浓度肝素具有强大的负电荷 ,能吸附酶标记物不易洗 脱有关； EDTA、3 / 6 酶抑制剂（如 NaN3）可抑制 LISA 系统中的辣根过氧化物酶活性，造成假阴性。 .2 标本保存不当 ,在冰箱内保存过久的标本 ,血清中 IgG 可聚合成多聚体、 AFP 可形成二聚体。标本放置时间延长（如一天以上），有时抗原或抗体免疫活性减弱，便出现假阴性。因此若采血后不能及时检测， 5 天内检测标本分离血清置于 4。 C 冰箱内；超过 5 天不能检测的，应放在 -20。C 低温冰箱中。 3.3 低浓度 HBsAg 标本（弱阳性 HBsAg）易受加样时间（特别是大批量标本）、试剂平衡时间、溶血程度的影响，出现假 阴性。如加样时间在 30 分钟内的差异是最大的。 3.4 高浓度 HBsAg 在 ELISA 一步法检测中易出现假阴性，即 HBsAg 的钩状效应。从原理来讲，一步法中 HBsAg 与包被板上的 HBsAb 及酶结合的 BsAb 结合是双向的，当HBsAg 浓度过高时， HBsAg 与包被板上的抗体及酶结合物中的抗体均是单向结合，不能形成抗体抗原抗体酶复合物，使酶标记抗体在随后的洗板中洗掉，从而显出阴性结果。但是在 ELISA 两步法中，高浓度的 HBsAg 只能与包被的HBsAb“ 饱和 ” 地结合，多余部分被洗掉，随后加入的酶结合的 HBsAb 正好通过 HBsAg 的 “ 桥梁 ” 作用而结合在酶标板上，显示阳性结果。因此当 HBsAg 强浓度时用 ELISA 一步法4 / 6 检测存在假阴性现象。解决此问题的最好办法有：对标本进行稀释；不单检测 HBsAg；采用 LISA 两步法检测可消除漏检现象。 3.5 由于慢性病毒携带者 (低水平 HBsAg 携带者 )或BV 感染的潜伏期 ,HBsAg 浓度低于检测水平的下限，由此造成假阴性。 3.6 S 基因突变导致 HBsAg 的氨基酸结构改变，由于多数商用试剂盒检测系统采用的为多克隆抗体检测 HBsAg 的a 决定簇，这一区域的点突变即可导 致临界观测值或阴性结果，造成假阴性。 3.7 药物的影响：高效价的乙肝免疫球蛋白会与HBsAg 形成复合物，影响 HBsAg 的检出，所以一些 HBsAg 阳性的患者注射高效价乙肝免疫球蛋白后， HBsAg 检测呈假阴性反应。用 .5M 的盐酸处理标本 1 小时可提高 HBsAg 的检出率。 ELISA 法假阳性原因 4.1 溶血或红细胞：有国内报道酶免 HBsAg 试剂检测溶血标本时可造成假阳性，因红细胞破坏溶解时释放出大量血红蛋白，血红蛋白的亚铁血红素具有弱过氧化物酶活性，其作用效应与辣根过氧化物酶（ HRP）类似 ，能与预包被抗体（ Ab）结合，一步法洗脱步骤往往难以完全洗脱，残留的过氧化物酶催化底物四甲基联苯胺（）产生假阳性。5 / 6 因此在采集血标本时，量不能太少，操作过程中如果血清混浊，一定要离心后再吸样，避免红细胞加入造成假阳性。对于溶血的标本最好重新采集血液，进行重新检测。 4.2 标本凝集不全或标本离心处理时采用不同的离心转速和离心时间 ,也可造成假阳性结果。若在血液还未开始凝固时即强行分离血清，此时的血清中仍残留部分纤维蛋白原，在 ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；离心转速 过低或离心时间过短，由于血液离心不充分均可导致假阳性。解决的办法最好是血液标本采集后放水浴箱，使其充分凝固再用 3000rpm,离心 5 分钟再分离血清。 4.3 干扰物质的影响：如类风湿因子（ RF）、补体、 AFP 等可以造成 HBsAg 检测结果假阳性。 RF 因子可与标记二抗的Fc 段结合造成假阳性；补体从 C1q 活化，使一抗和酶标二抗的抗体分子发生变构， c 的 q 分子结合点暴露出来，则补体 q 可将二者连接起来造成假阳性，采用 6。 C30分钟灭活补体可降低假阳性率；高浓度的 AFP（如孕妇），在储存过程中可能形成 二聚体会导致本底过深造成假阳性结果。 4.4 某些细菌污染标本 (如表皮球菌等 ),菌体中可能含有内源性 HRP，造成检测结果假阳性。 6 / 6 综上所述，在进行 HBsAg 实验室检测时，为了最大限度地减少假阳性和假阴性结果的出现，在正确处理血液标本的基础上，原则上应该采取 ELISA 法进行初检 ,若为阳性 ,则用金标法进行复检 ,仍为阳性 ,则报告结果阳性；若为阴性，则用ELISA