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引物的应用常识引物的原理引物是短的寡核苷酸片段，充当DNA复制的起点。因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3-羟基作为DNA合成的起始点。这个3-羟基由相配的引物提供。在体内，由于DNA聚合酶的忠实性，不能从头合成DNA，因此只能由RNA聚合酶（称为引物酶）生成，采用RNA引物来延伸，在延伸过程中，RNA引物降解并由DNA取代。在体外PCR反应中所用到的DNA引物，是根据不同的要求及模板序列设计，然后用化学法人工合成的，与模板形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸；对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。1. 不同实验要求的引物选择 在开始设计引物之前，必须弄清以下几点：（1）明确PCR的目的（例如克隆、SNP检测、定量检测等）（2）确定样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）（3）确定PCR的类型（普通的、定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)，在查找序列的时候还需要考虑可能存在的问题（如假基因等）2.引物设计的重要因素 有一些不同的软件工具可用于引物设计和引物分析。引物设计的软件如Oligo 6.22 ，Premier 5.0，Primer Express 3。引物分析常用Primer 5，Oligo 6.22，Primer-Blast。目前生工生物给客户提供的引物设计服务引物用的是在线软件Primer 3 plus， 引物长度和专一性常见的引物长度为18-30个碱基。 短的引物（15碱基）能非常高效地结合, 但是它们的专一性不够。较长的引物能提高专一性，然而退火效率低，从而导致PCR产量低下。同时应避免编码单一序列和重复序列的引物。 平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域引物的GC含量应介于40%60%之间。应避免聚-（dC）-或聚（dG）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。聚-（dA）-和聚（dT）-也应避免，因为这样会形成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。 3-序列3端为G-或C-核苷酸较好，因为能增加结合强度。同时它将提高PCR效率，因为引物-模板符合物的开放将达到最小。但是，超过3个G/C碱基将会具有负面效果，因为会降低反应的专一性。 避免互补的引物序列引物设计应避免引物自身序列的互补性超过3个碱基。因为这容易使引物形成自身发夹结构。 ACGGATACCATGCCTATG上下游引物之间的互补配对也应避免，尤其在作为扩增起始点和关键区域的3端。因为这将导致强引物二聚体形成，后者将与所需要的PCR反应竞争资源，导致PCR效率降低，在极端情况下，甚至导致完全无特异性目的产物生成。 退火温度是基于引物的解链温度（Tm）-计算方法。最常用的解链温度计算公式如下三种：“2+4”法则，亦称华莱士法则，对于14个碱基以下引物有效， 另外，还有GC法则，适用于长于13个碱基的序列，这两种方法都相对不准确。“盐调整”法相对准确一些，考虑到了反应缓冲液中的中的Na+离子浓度(50 mM Na+ ,pH 7.0)。但是不管根据哪种方法计算出的解链温度，都可用于估算最佳退火温度，也都仅作为实验参考温度。引物使用的常见问题： Q-1：OD值的概念？A-1: OD是optical delnsity（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，OD1og（1trans），其中trans为检测物的透光值。 吸光度（absorbance），是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数，影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等，吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关。只要光的波长被固定下来，同一种物质，吸光系数就不变。引物是以OD260值来计量的。在1ml的1cm光程标准石英比色皿中，260nm波长下吸光度为1的引物溶液定义为1 OD260。虽然对于每种特定的寡核苷酸来说，其碱基的组成不尽相同，但1 OD260 引物的重量约为33ug，每个碱基的平均分子量约为330 Da。因此合成的引物摩尔数可按以下公式近似计算： 摩尔数(mol) = OD值*33/碱基数*330 = 0.1* OD值/碱基数。 Q-2：需要合成多少OD的引物？A-2: 一般来说，20BP 2 OD引物可以做400-500次50ul标准PCR反应，以及 20002500 次的测序反应。因此，2 OD 的DNA 量足以进行一般的实验工作。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了，无论是 PAGE 纯化，还是 HPLC 纯化，增大每次的纯化量会大大降低制品的纯度。为了保证制品质量，我们一般把每次的纯化量控制在 2 OD 左右。Q-3：如何测定引物的OD值?A-3: DNA的量与260nm处的吸光度值(OD值)成正比，因此使用紫外分光光度计定量是最科学的，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。例如：您拿到一管引物DNA干粉，用1ml水溶解成母液。取该母液50L稀释成1ml，在1ml标准比色杯中测定其吸光度为0.25，说明该50L中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。Q-4：最长可以合成多长的引物？A-4:引物越长，出现问题的概率就越大。除非需要，建议合成片段长度不要超过80碱基，如果您的实验需要，我们可以接受110 碱基以下的订单。 Q-5：为什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？Q-5：引物应该全是DNA，但是OD260/OD280的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染？引物化学合成，哪里有机会污染到蛋白质？需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。下表是一个20碱基同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。Q-6：否根据引物电泳后EB染色后条带的亮度对合成的引物进行定量?A-6: 不能，EB是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。合成的DNA分子为单链，只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构，才能被EB染色。由于不同引物的序列不同，形成双螺旋的能力不同，因此染色能力不尽相同，也就不能根据EB染色带的亮度来对合成的DNA进行定量。建议用紫外分光光度计的方法如上面题Q-3中的方法.Q-7：引物定量不准的可能原因有：我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告，出现这种情况的可能性有：（1）生产人员定量错误。这种可能性有，但是不大，因为我们的生产人员都是经过严格的培训，程序化规范操作和换算。公司内部的考核机制也使得分装人员没有必要故意少给用户OD数。（2）引物抽干或收样过程中，引物干粉可能意外丢失。这种情况很少见。（3）系统误差，我们认为10%左右为允许误差。使用过程中，引物工作浓度范围很宽，定量上的少许偏差不影响实验。（4）用户没有能够正确理解引物OD数的含义，没有能够正确使用分光光度计，特别是使用微量测定；或者用户没有将OD读数，正确地转换成母液中的OD数。这种情况比较常见。（5）用户收到引物干粉时，打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。Q-8: 用3%的琼琼脂糖凝胶电泳合成的引物，为什么有很多条带？Q-8: 引物是单链 DNA ，容易形成复杂的立体结构，因此进行琼脂糖电泳时，容易出现多条泳带（更不能用琼脂糖电泳来进行定量了）。Oligo DNA 的电泳一定要使用变性 PAGE 电泳，琼脂糖电泳对于小单链的DNA引物的区分度不够。而且，用荧光TLC板在紫外灯下观察，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用银染方式染色。Q-9:引物溶解后发现有少许沉淀，会影响实验结果吗? A-9： DNA制品使用C18柱进行吸附，偶而会有微量的树脂溢出而进入制品。树脂不影响任何反应结果，请稍许离心后取上清使用即可。Q-10：琼脂糖电泳时，长度完全一样的 Oligo DNA 为什么泳带不在同一位置 ?A-10：A 、G 、C 、T 的组份不同，电泳速度不同；DNA 的立体结构不同，电泳速度不同；Oligo DNA 越短时越容易发生，长链 Oligo DNA 之间差别较小 Q-11：合成引物的 5和3 末端有磷酸基团吗?Q-11: 5 和3端均为 - OH 基。如需要加磷酸基团，订货时请特别注明，此时需收取磷酸化的费用。Q-12：5端的 PCR 产物难以克隆，为什么?A-12: 由于一般的 PCR 用引物的 5末端都没有 P ，因此，扩增后的 PCR 产物的 5末端也没有 P 。当克隆于去磷酸化的末端平滑载体时，无法克隆进去；而当克隆于非去磷酸化的末端平滑载体时，背景会极高。此时请对 PCR 产物的 5端进行磷酸 (P) 化处理。Q-13: 如何溶解并保存引物？Q-13: 客户收到的引物干粉，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。干燥的引物在常温至少可以稳定存放二周以上不会降解，由于干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好在3000-4000转/分的转速下离心1分钟，防止开盖时引物散失。我们的的合成报告单给出了每OD引物稀释为100mol/L（即100pmol/ul）浓度的加水量，您可以根椐您的实验需要加入适量的灭菌的双蒸水或10mM TE缓冲液（PH 7.5-8.0），室温放置几分钟，上下颠倒混匀后分装成小份放-20冰