怎样选择色谱柱_液相色谱柱的种类与方法开发.ppt

液相色谱柱的选择和方法开发,奥秘科技/AUMI Technologies （US）,内容概要,色谱基本概念回顾 色谱柱类型、选择和方法开发,色谱基本概念回顾,色谱（chromatography）,色谱原理 色谱分类：气相/液相和高效液相（HPLC）；反相/正相/离子交换/HILIC/混合固定相 色谱功能：分析（种类/定量），纯化 液相色谱仪器结构及功能：泵，脱气机，混合器，进样器（阀），色谱柱，柱温箱，检测器（流通池）,分离度,Rs - Resolution N Theoretical Plate Number Selectivity k Retention Factor 拖尾,1.Separation of Compounds A and B,灵敏度,：Limit of Detection ：Limit of Quantification 柱效 峰形（拖尾因子）,重现性,分离度（） 保留时间（，） 选择性（ ） 柱效 （） 灵敏度,色谱柱类型、选择和方法开发,色谱柱与色谱条件对色谱性能的影响,分离度 - 选择性 键合类型，基质表面特性；流动相、温度 - 柱效 保留体积，粒径，柱长，基质表面特性；流动相， 温度，上样量，流速 峰对称性 基质表面特性，键合类型，流动相，温度 保留体积 柱长，孔隙率，比表面积，基质表面特性，键合类型；流动相，温度 灵敏度 粒径，基质表面特性，键合类型；流动相，温度 稳定性和重现性 基质表面特性，键合类型；流动相，温度 流动相 pH，缓冲盐种类，溶剂；,影响色谱柱性能的主要因素,1、 色谱柱的构型 色谱柱内径 色谱柱长度 2、 固定相柱填料 粒径 比表面积 孔径 孔隙率 基质表面特性： - 表面活性：硅胶纯度、硅羟基的酸性、均匀性和数量 - 耐碱性 键合类型 - 官能团、是否封尾 - 键合相的保留行为、耐酸性,色谱柱的构型对色谱柱性能的影响,色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径,色谱柱尺寸 对色谱分离的影响： 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长 窄径柱 ( 2.1mm) 满足检测器和样品量限制 宽径柱 (3-7.8 mm) - 载样量高，抗污染，寿命 制备柱 (内径 10 mm) 用于纯化制备,柱填料对色谱柱性能的影响,柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径,硅胶粒径和类型对柱效的影响,d,硅胶粒径和类型对压力的影响,柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径II,目前市场主要可供选择的填料粒径 1.7m，1.8m，2.2m 快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪 2.7m 多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo) 3.0m，3.5m 普通快速分析 5.0m 常规分析,颗粒越小，柱效越高, 但是耐污染性能下降，柱压升高.,柱填料对C18色谱柱性能的影响：比表面积,每克填料的表面积，与粒度，孔径有关 比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间增加(梯度洗脱尤为注意) 根据需要选择合适的比表面积,柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径I,多孔材料的95%以上表面在孔内部 样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部 孔径至少是样品流体学直径的4倍 300孔径用于：超过50个氨基酸的肽或25个残基的低聚寡核苷酸,样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部,柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径II,由于小孔径填料比表面积大，小分子的保留值在小孔径填料通常更大,条件： C8色谱柱，4.6150mm， 3.5um， A溶剂，0.1%TFA水溶液； B溶剂，0.1%TFA于80%乙腈 水中； 20min梯度，10 30%B；60C， 1.5ml/min,柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度I,2.3-二羟基萘,2.7-二羟基萘,TF=1.31,Brand W, AQ Column 5m, 4.6mm150mm,Brand Z,C18 Column 5m, 4.6mm150mm,Venusil MP C18 5m, 4.6mm150mm,Brand H, C18 Column 5m, 4.6mm150mm,Brand U,C18 Column 5m, 4.6mm150mm,！,TF=1.42,TF=1.39,TF=1.69,TF=？,流动相： 甲醇：水=65：35 流速： 1 mL/min 温度： 35 检测波长： 230 nm 进样量： 20 L,硅胶纯度金属含量,硅胶基质类型及发展史,Type A：原料来源：水玻璃；高金属含量，高活性，极性化合物容易形成拖尾和死吸附 Type B：原料来源：有机硅烷（四乙氧基硅烷）水解/烧结/酸洗 杂化及表面杂化 整体柱 壳层柱,柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度II,硅胶纯度金属含量,d,固定相对色谱柱性能的影响：硅羟基的影响,残余硅羟基的影响 普通硅胶当流动相的 pH 值大于 4.5-5.0 时，表面的硅羟基会带负电荷，碱性化合物拖尾。 解决方法 封尾 双层表面修饰 表面杂化,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,封尾 键合填料与小硅烷进行后续反应，如三甲基氯硅烷，反应掉部分残余硅羟基，以增加表面覆盖率。 缺点： 不能完全反应（仍有50%的硅羟基未被反应） 在pH3时，TMS易流失，耐用性，稳定性不好,TMS,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,不同长度和体积的键合相对表面覆盖率的影响,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,双层表面修饰 降低表面硅羟基活性，硅胶表面更加均匀,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,硅胶双层表面修饰后 新增加表面层硅羟基活性更低新硅羟基pH=5.2， 普通硅羟基pH约为3.5 更对称的峰型，提高柱效，提高灵敏度 硅胶表面更均匀硅胶微晶形成过程中的不光滑表面被覆盖 重现性更好 表面纯度更高硅胶金属杂质被覆盖 极性化合物保留和分离更好,键性化合物峰形对比,Test conditions: Column dimension: 4.6 mm x 150mm Sample: doxepin, nortriptyline, trimipramine amitriptyline Mobile phase: Acetonitrile/0.01M sodium phosphate (pH=6) = 70/30 Temperature: 30 oC Flow: 1 mL/min Detection: UV 254 nm,Brand A C18( non-endcapped, ),C18 (non-endcapped, twin-layer,ASB C18,Zorbax SB C18,Saponins Extract,4.6x150 mm column, 1% formic acid/MeOH= 80/20,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,双层表面修饰 代表产品： StableBond C18，PolarBond C18，SurfBond C18,0.01 ng/mL Pseudoephedrine,AUMI Baulo StableBond C18, 2.150mm, 5m,Brand A C18 2.150mm, 5m,Phenomenex Luna C18, 2.050mm, 5m,固定相对色谱柱性能的影响：键合类型,A 纵向交联：保留和选择不稳定 B 横向交联：宽pH适用 C 单体键合：重现性好，柱效高 D 单体（空间保护）：低pH稳定 极性官能团嵌合反相固定相,固定相对色谱柱性能的影响： 基质表面特性+键合类型 反相键合相的保留行为,同一厂家相同硅胶基质的反相柱： 保留值随含碳量的增加而增加 比表面积越大，保留值越大 键合碳链越长，保留越大 C18 C8C3C1，长链之间差别不大,反相键合相的保留行为,不同厂家色谱柱的 保留值，选择性与峰型 色谱柱：4.6*150mm，流动相：乙腈0.05M磷酸钾缓冲液，pH3.2(65:35);流速：1ml/min，,拖尾峰,T0（尿嘧啶）,P: 吡啶 L: 苯酚 N: N,N-二甲基苯胺 B: 4-丁基苯甲酸 J: 甲苯,固定相对色谱柱性能的影响： 基质表面特性+键合类型 键合相的稳定性,键合相的稳定性 低pH值，键合相流失 高pH值，硅胶溶解 影响色谱柱寿命，方法不重现,键合类型对键合相稳定性影响,低pH值，键合相流失,键合类型对键合相稳定性影响（II）,空间位阻保护，延缓键合相流失,固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性,高pH值，硅胶基质溶解,pH9时，色谱柱的稳定性,固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性,碳杂化，延硅胶缓高pH值水解,杂化颗粒： Waters Xterra,表面碳杂化示意图,pH=12 条件下的稳定性,4 amines, ACN/ 1% Ammonia aqueous= 25%:75%, 40oC, 4.6 x 150 mm, 5um,1h,200 h,总结：如何选择色谱柱和相应的色谱条件,了解目标化合物的性质：结构（官能团）、pKa、分子量、浓度范围、溶解度、极性 了解色谱柱的性质 粒径，孔径，比表面积 保留强度和柱效；抗污染性 基质表面特性，键合类型保留强度，选择性，柱效，对称性，灵敏度，稳定性和重现性 选择相应的色谱条件,色谱柱选择 （）,替代：粒径，比表面，基质表面特性，键合类型相似 新方法开发： 粒径：2um vs 3um vs 5um （分析时间，灵敏度，仪器，价格，寿命） 内径柱长：内径3mm vs 4.6 vs 7.8（对分离影响不大，成本）；柱长与粒径相关 比表面：（低比表面耐污染，高比表面利于分离） 孔径： 在满足比表面前提下大孔径