天麻萌发菌、蜜环菌培养技术规程.doc

ICS点击此处添加ICS号点击此处添加中国标准文献分类号DB62甘肃省地方标准DB 62/ XXXXXXXXX陇南市天麻萌发菌、蜜环菌培养技术规程点击此处添加标准英文译名点击此处添加与国际标准一致性程度的标识2014 - XX - XX发布2014 - XX - XX实施甘肃省质量技术监督局发布DB62/ XXXXXXXXX目次前言III1范围12规范性引用文件13术语和定义13.1萌发菌13.2蜜环菌13.3菌材13.4母种13.5原种13.6栽培种14萌发菌、蜜环菌的培养24.1培养条件24.2菌种培养24.2.1萌发菌、蜜环菌一级菌种（母种）培养24.2.1.1PDA培养基制备24.2.1.2菌种选择24.2.1.3分离方法24.2.1.4菌种纯化34.2.2萌发菌、蜜环菌二级菌种（原种）培养34.2.2.1萌发菌二级菌种培养34.2.2.2蜜环菌二级菌种培养34.2.3萌发菌、蜜环菌三级菌种（栽培种）培养34.2.3.1萌发菌三级菌种培养34.2.3.2蜜环菌三级菌种培养34.2.4菌种保藏34.2.4.1一级菌种保藏34.2.4.2二级菌种和三级菌种保藏34.3蜜环菌枝培养44.3.1树种选择44.3.2培养时间44.3.3培养方法44.4蜜环菌材培养44.4.1菌种准备44.4.2树种选择44.4.3培养时间44.4.4木材准备44.4.5场地选择44.4.6培养方法44.4.7培养管理54.4.7.1调节湿度54.4.7.2调节温度55菌种质量55.1母种质量55.1.1直接观察55.1.2显微镜检查55.1.3观测菌丝长速55.1.4耐高温测试55.1.5吃料能力鉴定55.2栽培种质量55.2.1质量指标55.2.2验收规则66标志、包装、运输、贮藏66.1标志66.2包装66.3运输66.4贮藏6前言本标准根据GB/T1.12009给出的规则编制。本标准由陇南市农牧局提出。本标准起草单位:陇南市农业科学研究所、甘肃省中草药资源开发利用工程技术研究中心本标准主要起草人：王义存、乔旭、张 杰、杨广孝、杨正文、尹玉保、武建华6陇南市天麻萌发菌、蜜环菌培养技术规程1 范围本标准规定了陇南市天麻萌发菌、蜜环菌培养技术的术语和定义、萌发菌、蜜环菌菌种的培养。本标准适用于陇南市天麻主产区及其它同类气候环境区域天麻萌发菌、蜜环菌固体菌种的生产。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 191 包装储运图示标志GB 5749 生活饮用水卫生标准GB 9687 食品包装用聚乙烯成型品卫生标准GB 9688 食品包装用聚丙烯成型品卫生标准NY 5099 无公害食品 食用菌栽培基质安全技术要求3 术语和定义3.1 萌发菌天麻（Gastrodia elata Bl.）种子的萌发靠小菇属(Mycena)一类真菌菌丝侵染种胚提供营养而萌发，这类促进天麻种子萌发的真菌称为天麻种子萌发菌。主要包括：紫萁小菇(Mycena osmundicola) 、石斛小菇(Mycena dendrobii)、兰小菇(Mycena orchicola)和开唇小菇(Mycena anoectochila)。3.2 蜜环菌蜜环菌（Armillaria mellea）是担子菌纲伞菌目真菌，天麻种子萌发后，其所需营养逐渐由蜜环菌供给，是天麻不可缺少的互惠共生菌。3.3 菌材生有蜜环菌或萌发菌的木棒、树枝、树叶统称为菌材。菌材是培养天麻所必备的材料，包含：菌棒：指生长有蜜环菌的木棒。菌棒采用直径410 cm的木棒，主要用于培养天麻。菌枝：指生长有蜜环菌的树枝。菌枝采用直径23 cm的树枝，是培养天麻的补充材料。菌叶：指生长有萌发菌的树叶。菌叶是萌发菌三级种的主要组成。3.4 母种从菌索、子实体、着生菌丝体的天麻块茎，经各种方法分离得到的纯菌丝体培养物及其继代培养物，以玻璃试管为培养容器和单位，也称一级种、试管种。3.5 原种由母种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。常以菌种瓶或聚丙烯塑料袋为容器，也称二级种。3.6 栽培种由原种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。常以塑料袋为容器。栽培种只能用于栽培，不可再次扩大繁殖菌种。4 萌发菌、蜜环菌的培养4.1 培养条件萌发菌、蜜环菌的培养必须在无菌条件下进行，需要有接种室、接种箱或超净工作台、接种工具；菌种培养室、恒温培养箱、菌种培养架；高压蒸气灭菌锅、电热干燥箱，紫外灭菌灯；菌种保藏用电冰箱；化学药品，试管、天平等。菌种和基质质量标准应符合NY5099的规定和要求。使用水源符合GB 5749的要求。4.2 菌种培养4.2.1 萌发菌、蜜环菌一级菌种（母种）培养4.2.1.1 PDA培养基制备PDA培养基：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1000 ml、pH 56。配制方法：将马铃薯切片，加水煮沸30 min，用纱布过滤，取滤液1000 ml并放入琼脂加热，使之全部融化，最后加入葡萄糖，溶解后调节pH为56。然后将培养基趁热分装于试管内，经高压灭菌（1.5 kg/cm2）30 min。取出后按25斜度放置冷却后接种。消毒灭菌：接种室灭菌每立方米用40%的甲醛溶液8 ml，高锰酸钾5 g进行熏蒸。先关闭窗户，取甲醛溶液装入容器中，再放入高锰酸钾，人随之离开接种室，关闭房门，熏蒸1 h即可。熏蒸后应隔1 d使用。4.2.1.2 菌种选择使用正规菌种厂生产的优良品种；或采收天麻种子发芽后的原球茎、兰科植物中的根部、诱导培养萌发菌子实体。用以上材料分离培养菌种。4.2.1.3 分离方法4.2.1.3.1 组织分离萌发菌分离：将天麻种子萌发的原球茎用自来水冲洗干净，然后用无菌水冲洗数次，置于灭过菌的小培养皿中，原球茎用0.1氯化汞溶液浸泡消毒12 min，用灭菌小剪刀剪成23段，在金霉素液中蘸一下，即可接人PDA平面培养基中，置于25 恒温箱内培养，310 d即可发出菌丝。蜜环菌分离：将蜜环菌索或天麻块茎，或天麻原球茎，或兰科植物的根分别用水洗净表面泥土，然后切取需要的部份组织，用无菌水冲洗3次，放入0.1%氯化汞溶液浸泡1 min；再用无菌水冲洗3次，洗去残存的药液，置于无菌培养皿内。或将菌索等材料分别剪成1 cm长的小段或小块，在青霉素液（20 g/ ml）中浸片刻，用灭菌滤纸吸去表面附着水液，然后接种于斜面培养基上，置25 恒温培养，37天左右，开始分别长出白色菌丝和菌索。分离子实体时，用无菌水冲洗消毒残存药液后，用灭菌滤纸吸净水珠，再用解剖刀从菌盖中纵向剖开子实体，在菌柄及菌盖交界处取其0.5 cm的一块组织置于PDA培养基上培养。4.2.1.3.2 孢子分离将开伞的子实体截去菌柄的下半部，用70%的酒精在菌盖表面及菌柄部分进行揩擦消毒，然后菌褶向下插在孢子收集装置的支架上。将支架放于无菌培养皿中，用钟罩或大烧杯罩住以收集孢子。孢子落于皿内后，用接种针挑取少许，接于斜面培养基上培养。4.2.1.4 菌种纯化萌发菌选用菌落生长速度较为一致的菌丝体，用消毒的接种铲连同培养基一起切取菌丝，转移到新的培养基上培养，重复转接可获纯菌种。蜜环菌在培养基上接种点处刚产生菌索分枝时，选择其中生长旺盛而幼嫩的菌索，用接种铲截取长23 mm移入斜面培养基上，在25 恒温下培养，菌索长满培养基后即为纯化的一级菌种。4.2.2 萌发菌、蜜环菌二级菌种（原种）培养4.2.2.1 萌发菌二级菌种培养培养基成分：青、桦木等阔叶树的木屑70%、麸皮或米糠26%、蔗糖1%、石膏粉1%、磷酸二氢钾1.5%、硫酸镁0.5%，加水适量。将以上成分充分拌匀，含水量65%，即用手捏培养基可略有滴水为度，然后装瓶，在瓶中心打直径1 cm的圆孔，深达培养基2/3处。盖好瓶盖，高压蒸气灭菌（1.5 kg/cm2）1 h，冷却后接种。在接种室内，将菌丝连同约蚕豆大小的母种，接于培养基的圆孔中，1支母种可接原种510瓶（袋）左右，盖好瓶盖后置25 培养室培养。4.2.2.2 蜜环菌二级菌种培养培养基成分为阔叶树锯木屑30%，麦麸10%及小树枝段，水适量。制作时，先将手指粗的树枝截成长1.5 cm的小段，在水中浸泡12 h充分吸水，然后与锯木屑、麦麸拌匀、加水湿透，装入500 ml广口瓶中，每瓶装入树枝段5060段，以瓶容量的4/5为宜，再加水少量，盖瓶盖后高压灭菌（1.5 kg/cm2）1 h，冷却后，接入母种，置于25 恒温培养，30天45天蜜环菌丝和菌索可长满全瓶。4.2.3 萌发菌、蜜环菌三级菌种（栽培种）培养4.2.3.1 萌发菌三级菌种培养取壳斗科植物落叶70%、木屑10%、麦麸15%、硫酸镁0.5%，磷酸二氢钾1.5%、尿素1%、蔗糖1%、石膏1%，水适量。经拌匀后装袋，高压蒸气灭菌（1.5 kg/cm2）1 h，冷却后接入二级菌种，封好袋子，移入培养室培养。4.2.3.2 蜜环菌三级菌种培养培养料和培养方法与二级菌种培养相同。在高压灭菌冷却后，每瓶接入二级树枝菌种12段，在25 恒温培养30 d45 d，蜜环菌丝和菌索可长满全瓶，可用于培养菌枝和菌材。4.2.4 菌种保藏4.2.4.1 一级菌种保藏当一级菌种长满试管后，用牛皮纸包扎好，放入0 4 的冰箱中，每隔3个月转管培养1次。使用时，应从冰箱中取出先经适应常温后再转管培养。包装储运标志符合GB 191的要求。4.2.4.2 二级菌种和三级菌种保藏二、三级菌种可在冷凉、干燥、清洁的室内保藏，室温在0 10 ，保藏期23个月。4.3 蜜环菌枝培养4.3.1 树种选择用作菌材的树木应是阔叶落叶树种。常用来培养菌材的树种有：桦树、野樱桃、法国梧桐、桃树、青岗栎、板栗、水冬瓜、刺槐、槲栎、橡树等，以甜、涩味、质硬耐腐的树种为宜。4.3.2 培养时间应根据需要，一般应在菌材培养期之前2个月进行。4.3.3 培养方法选择直径12 cm的树枝，斜砍成长34 cm的小段。其次，挖长2米，宽1米，深30 cm的坑；坑底先铺1 cm厚湿润树叶，然后摆一层树枝，再放入菌种，在菌种上再摆一层树枝，盖一薄层沙土，以覆盖填满树枝间空隙为度。可依次堆放810层，盖10 cm厚沙土，再盖一层树叶保温保湿。一般2个月可培养好菌种。4.4 蜜环菌材培养4.4.1 菌种准备菌枝是培养菌材最好的菌种。选择菌枝表面附着棕红色、幼嫩、有白色生长点、无杂菌污染的做菌种。也可用培养好的优质菌材作菌种。4.4.2 树种选择同4.3.1。4.4.3 培养时间选择在秋、冬季至春初培养菌材。4.4.4 木材准备选直径35 cm的树木，锯成长20 cm的木段，若树木直径在10 cm以上，应将木段劈成24块，在木段的一面或两面每隔34 cm砍一个鱼鳞口，深度至木质部为度。4.4.5 场地选择应选择在天麻种植场地附近，减少菌材搬运；坡度应小于20和向阳的山地，土壤以土层深度，疏松透气，排水良好的砂壤土，要有灌溉水源的地方为宜。4.4.6 培养方法培养方法有多种，现以窖培法为例。挖窖长2 m，宽1米，深30 cm。将窖底挖松整平，铺一层1 cm厚的树叶，平放一层树木段，如是干木段应提前一天用水浸泡24 h，在树木段之间放入菌枝45根，洒一些清水，浇湿树木段和树叶，然后用沙土或腐殖土填满树木段间空隙，并略高于树木段为宜。再放入第二层树木段，树木段间放入菌枝后，如上法盖一层土。如此依次放置多层，盖土厚10 cm成龟背状略高于地面，最后覆盖树叶保温保湿。4.4.7 培养管理4.4.7.1 调节湿度主要是保持菌材窖内填充物及树木段内适宜的含水水量即50%左右。应注意勤检查，根据培养窖内湿度变化进行浇水和排水。4.4.7.2 调节温度蜜环菌索在6 28 可以生长，超过30 生长受抑制，同时杂菌易繁殖。在18 20 温度条件适宜蜜环菌生长。在春秋低温季节，可覆盖塑料薄膜提高窖内温度。培养窖上盖枯枝落叶或草可以保温保湿。5 菌种质量5.1 母种质量5.1.1 直接观察对引进的菌种，首先用肉眼观察包装是否合乎要求，棉塞有无松动，试管、玻璃瓶或塑料袋有无破损，棉塞和管瓶或袋中有无杂菌和病虫侵染，菌丝色泽是否正常，有无发生老化，受光面是否产生子实体，含水量是否标准等。5.1.2 显微镜检查事先要准各好显微镜、载玻片、吸管、镊子、接种针、蒸馏水等物品在载坡片上放1滴蒸馏水，然后挑取少许菌丝置水滴上，盖好盖玻片，再置显微镜下观察玻片也可通过普通染色后进行镜检。菌丝透明，呈分枝状，有横隔，锁状联合明显。5.1.3 观测菌丝长速将供测的菌种接入新配制的试管斜面培养基上，置最适宜的温、湿度条件下进行培养。如果苗丝生长迅速，整齐浓密，健壮有力，别表明是优良菌种：若菌丝生长缓慢，或长速特快，稀疏无力，参差不齐，易于衰老，则表明是劣质菌种。5.1.4 耐高温测试将母种试管数支置于最适温度下培养，一周后取出部分试管置32培养，24 h后再放回最适宜温度下培养。经过这样偏高的处理，如果菌丝仍然健壮、旺盛生长，则表明该品种具有耐较高温度的优良特征：反之，菌丝生长缓慢，且出现倒伏发黄、萎缩无力，则可认为是不抗高温菌种。5.1.5 吃料能力鉴定将菌种接入最佳配方的原种培养基中，置最适宜的温、湿度条什下培养，一周后观察菌丝的生长情况。吃料萌发快，则说明吃料能力强：反之，则表明该品种对培养基的适应能力差。5.2 栽培种质量5.2.1 质量指标无害虫杂菌，上下一体，洁白一致，袋壁有少量水珠