乳及乳制品中β乳球蛋白的测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法.pdf

i c s6 7 1 2 0 0 1 b4 5 ny 中华人民共和国农业行业标准 n y t16 6 3 2 0 0 8 乳与乳制品中3 一乳球蛋白的测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 d e t e r m i n a t i o no f 3 - 1 a c t o l 目i o b u l i nc o n t e n ti nm i l ka n dd a i r yp r o d u c t s 2 0 0 8 0 7 1 4 发布2 0 0 8 0 8 1 0 实施 中华人民共和国农业部发布 前言 n y t1 6 6 3 - - 2 0 0 8 本标准中附录a 为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位。农业部食品质量监督检验测试中心( 上海) 。 本标准主要起草人：孟瑾、黄菲菲、韩奕奕、吴榕、陈美莲、何亚斌、王建军、韩惠雯。 i 1 范围 乳与乳制品中卢一乳球蛋白的测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 n y t1 6 6 3 - - 2 0 0 8 本标准规定t s l 与乳制品中口一乳球蛋白的s d s p a g e 凝胶电泳测定方法。 本标准适用于乳与乳制品( 生牛乳、奶粉、液态乳、奶酪、乳清粉) 中口一乳球蛋白的测定。 本标准液态样品的检出限2 4 m g 1 0 0 m l ，固液态和固体样品的检出限2 4 0 m g 1 0 0g 。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准，然而。鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 g b t6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 试样用s d s p a g e 凝胶电泳后，用光密度计对j 9 一乳球蛋白进行测定分析，求得卢一乳球蛋白的含 量。 4 试剂 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂 实验用水应符合g b t6 6 8 2 中一级水的规 定。 4 1 冰醋酸( c h 3 c o o h ) 4 2 磷酸( h 3 p 0 4 ) 4 3 硫酸铵 ( n h 。) 。s o 。) 4 4 过硫酸铵 ( n h 。) 2 s 2 0 8 4 6 甲醇( c h 。o h ) 4 6 乙醇( g h s o h ) 4 7 丙三醇( c 3 h 80 3 ) 4 8 甘氨酸( c 3 h 5 n 0 2 ) 4 9 三羟甲基氨基甲烷( c 4 h - 。n o a ) ：生化级 4 1 0 口一巯基乙醇( c 2 h 。o s ) ：生化级 4 ”丙烯酰胺( c 3 h ；n o ) 4 1 2n n - 甲叉双丙烯酰胺( c 7 h 1 0 n 20 2 ) ：生化级 4 1 3 十二烷基磺酸钠( h 2 5 s 0 3 n a ) ：生化级 4 1 4n ，n ，n ，nr - 四甲基乙二胺( c 。h 1 e n 。) ：生化级 4 1 5 溴酚蓝( c 1 9 h l o b r , 0 5 s ) 4 1 6 考马斯亮蓝r 一2 5 0 n y t1 6 6 3 - - 2 0 0 8 4 1 7 盐酸溶液 4 t o o l l ，量取3 6 m l 浓盐酸( h c l ) 注入5 0 m l 水中，定容至1 0 0 m l ，混匀。 4 1 8 丙烯酰胺单体贮备液 准确称取1 4 5 5g 丙烯酰胺( 4 1 1 ) 、0 4 5gn n - 甲叉双丙烯酰胺( 4 1 2 ) ，先用4 0m l 水溶解，搅 拌，直至溶液变澄清透明，再用水稀释至5 0m l ，过滤，备用。该贮备液在4 下棕色瓶中可保存一个月。 注：丙烯酰胺单体都是中枢神经毒物 ，j 、心操作。 4 1 9 浓缩胶缓冲液贮备液1m o v l 。p h6 8 准确称取6 0 6g 三羟甲基氨基甲烷( 4 9 ) ，溶解于4 0m l 水中，用盐酸溶液( 4 1 7 ) 调节p h 至6 8 后，用水定容至5 0m l ，4 “ c 下保存。 4 2 0 分离胶缓冲液贮备液 15m o l l ，p i t8 8 准确称取9 0 8g 三羟甲基氨基甲烷( 4 9 ) ，溶解于4 0m l 水中，用盐酸溶液( 4 1 7 ) 调节p h 至8 8 后。用水定容至5 0m l ，4 保存。 4 2 1 过硫酸铵溶液。1 0 0g l 准确称取0 。1g 过硫酸铵( 4 4 ) ，加1 m l 水溶解，使用前配制。 4 2 2 十二烷基磺酸钠溶液，1 0 0g l 准确称取5g 十二烷基磺酸钠( 4 1 3 ) ，用水溶解定容至5 0m l ，室温保存。 4 2 3n ，n ，n n - 四甲基乙二胺溶液。体积分数为1 0 量取0 1 0 m l n ，n ，n7 ，n - 四甲基乙二胺( 4 1 4 ) ，加水稀释定容至1 0 0 m l 。 4 2 4 样品缓冲液0 0 8m o i l 精确称取4 m g 溴酚蓝( 4 1 5 ) ，溶解于5 0 0 m l 水中，分别量取1 6 0 m l 浓缩胶缓冲液贮备液 ( 4 1 9 ) 、4 0 0 m l 十二烷基磺酸钠溶液( 4 2 2 ) 、1 2 0 m l 曰一巯基乙醇( 4 1 0 ) 、2 2 0 m l 丙三醇( 4 7 ) ，全 部混合后用水稀释定容至2 0m l ，4 保存。 4 2 5 电极缓冲液p i t8 3 分别准确称取3 0g 三羟甲基氨基甲烷( 4 9 ) 、1 4 4g 甘氨酸( 4 8 ) ，加入十二烷基磺酸钠溶液 ( 4 2 2 ) 1 0 m l ，调节p h 至8 3 ，定容至10 0 0 m l 。 4 2 6 考马斯亮蓝染色液2 5g l 称取0 z 5g 考马斯亮蓝r 一2 5 0 ( 4 1 6 ) 承1 1 0g 硫酸铵( 4 ，3 ) - 分别加入z o n 儿乙醇( 4 6 ) 、1 0 n l l 磷 酸( 4 2 ) ，溶解混匀，用水定容至1 0 0m l 。 4 2 7 脱色液 分别量取7 5 m l 冰醋酸( 4 1 ) 、5 0 m l 甲醇( 4 5 ) 、8 7 5 m l 水混匀。 4 2 8 口- $ l 球蛋白标准溶液，10 0m g i n l 精确称取o 0 1 00g 口乳球蛋白标准品( 纯度9 0 ) ，用样品缓冲液( 4 2 4 ) 定容至1 0m l ，沸水浴 中加热3m i n 5m i n ，在- - 2 0 以下保存。 5 仪器设备 常用实验宣仪器及以下各项。 5 1 天平，感量0 0 0 01g 。 5 2 电泳仪。 5 3 电泳槽，1 0 0m m x 8 3 m i d - 。 5 4 光密度扫描仪。 5 5 微量注射器，1 0 肛l 。 2 5 6 离心机，不低于70 0 0r m i n 。 5 7 磁力搅拌器。 5 8 具塞离心试管。 6 分析步骤 n v t1 6 6 3 - - 2 0 0 8 6 1 试样制备 6 1 1 液体样品 取1m l 样品，依次加入1m l 水和2m l 样品缓冲液( 4 2 4 ) ，沸水浴加热3m i n 5m i n ，磁力搅拌器 ( 5 7 ) 搅拌4h ，离心5r a i n ，去除脂肪，取上清液分装，在- - 2 0 保存，备用。 6 1 2 固体样品 称取1g 样品，精确到0 1 m g ，加适量水溶解，定容至1 0 m l ，按6 1 i 操作。 6 2 分离胶制备 按表1 配制1 2 分离胶2 0m l ，混匀后加入到长、短玻璃板间的缝隙内，约6 0m m 7 0i d _ t n 高。沿 长玻璃板板壁缓慢注入约5 m m 高的水，进行水封。约3 0r r d n 后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界 线，则表示凝胶完全聚合。倾倒去水封层的水，再用滤纸条吸去多余水分。 6 3 浓缩胶制备 按表1 配制3 浓缩胶1 0m l 。混匀后加到已聚合的分离胶上方。直至距离短玻璃板上缘约5m m 处。轻轻将样品槽模板插人浓缩胶内，约3 0 r a i n 后凝胶聚合，再放置2 0 m i n 3 0 m i n ，使凝胶老化。 裹1 不连续电泳的凝胶配方( 垂直电泳) 贮液3 浓缩胶1 2 分离胶 丙烯酰胺单体贮备液( 4 1 8 ) 2 5 m l 1 2 m l 浓缩胶缓冲液贮备液( 4 1 9 ) o 6 m l 分离胶缓冲液贮备液( 4 2 0 ) 7 5 m l 十二烷基磺酸钠溶液( 4 2 2 ) 5 0u l 3 0 0u l 水 1 _ 8 2 m l1 0 m l n ，n ，n ，n i 四甲基乙二胺溶液( 4 2 3 )5 “l2 0 “l 过硫酸铵溶液( 4 2 1 ) 2 5 “l2 0 0u l 6 4 装槽 水平取出梳子，将胶板垂直放人电泳槽中，并灌入新配置的电极缓冲液( 4 2 5 ) ，浸没玻璃板上边缘， 胶板底部不要有气泡。 6 5 上样 用微量进样器分别加入卢一乳球蛋白标准溶液( 4 2 8 ) 2 止和试样( 6 1 ) 2 止。 6 6 参考电泳条件( 恒电流) 浓缩胶中浓缩3 0m a ! 分离胶中分离3 0m a 。 6 7 染色 剥出的凝胶用水清洗三次，浸泡在盛有考马斯亮蓝染色液( 4 2 6 ) 的器皿中，染色1 2h 。 6 8 脱色 染色后的凝胶先用水冲洗表面的多余染料，再用脱色液( 4 2 7 ) 浸泡脱色。更换脱色液，至凝胶背景 无色为止。 6 9 分析 用光密度计对凝胶进行测定分析，根据光密度值计算口一乳球蛋白的含量，典型图谱参见附录a 。 3 n y t1 6 6 3 - - 2 0 0 8 7 结果计算 试样中口一乳球蛋白含量以质量分数x 计，数值以毫克每百克或毫克每百毫升( m g 1 0 0g 或m g 1 0 0 m l 表示，按式( 1 ) 计算： x = 舞g “鲁x v 毪x f x l 0 0 ( 1 ) 式中： o n 试样溶液中口一乳球蛋白的光密度值i g 一标准溶液中口一乳球蛋白的浓度，单位为毫克每毫升( r a g m l ) 样品定容体积，单位为毫升( m l ) i o d ，“口一乳球蛋白标准溶液的光密度值； 试样的上样体积，单位为微升( p l ) ； v 8 一乳球蛋白标准溶液上样体积单位为微升( p l ) i ，- 稀释倍数； m 试样的质量，单位为克( g ) 。 测定结果用平行测定的