植物乳杆菌ST-Ⅲ脱脂乳的发酵工艺优化.pdf

第 30 卷 第 11 期 农 业 工 程 学 报 Vol.30 No.11 276 2014 年 6 月 Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering Jun. 2014 植物乳杆菌 ST-脱脂乳的发酵工艺优化 华宝珍，李 莎，徐爱才，徐志平，马成杰 （乳业生物技术国家重点实验室，光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海 200436） 摘 要：为研发富含植物乳杆菌 ST-新型益生菌发酵乳制品，该试验尝试用植物乳杆菌 ST-和嗜热链球菌共发 酵，并对植物乳杆菌 ST-发酵乳的工艺进行了优化研究。通过单因素试验分析了大豆多肽添加量、葡萄糖酸锰 添加量、嗜热链球菌的接种量和发酵温度对发酵乳的 pH 值和植物乳杆菌 ST-活菌数的影响。通过响应面法优化 并确定了最佳工艺条件：大豆多肽添加质量分数 11 g/kg；葡萄糖酸锰添加质量分数 11 mg/kg；嗜热链球菌的接种 量 106 CFU/g；植物乳杆菌 ST-的接种量 106 CFU/g；发酵温度为 37 。在此优化最佳工艺条件下，发酵乳的植 物乳杆菌 ST-的活菌数为 1.88109 CFU/mL，有效地提高了发酵乳中植物乳杆菌 ST-的活菌数。研究结果可为 拓展植物乳杆菌 ST-在乳制品领域的应用提供参考。 关键词：发酵；优化；工艺；植物乳杆菌 ST-；发酵乳 doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2014.11.034 中图分类号：TS252.54 文献标志码：A 文章编号：1002-6819(2014)-11-0276-09 华宝珍,李 莎,徐爱才，等. 植物乳杆菌 ST-脱脂乳的发酵工艺优化J. 农业工程学报，2014，30(11)：276 284. Hua Baozhen, Li Sha, Xu Aicai, et al. Optimization of fermentation process in skim milk with ST- Lactobacillus plantarumJ. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2014, 30(11): 276284. (in Chinese with English abstract) 0 引 言 联合国粮农组织和世界卫生组织定义益生菌 为一种“当摄入充足的数量时，对宿主产生功能性 健康益处的活体微生物”1。由此可见，为了发挥 益生菌的功能与作用，益生菌菌株必须对人体消化 系统具有良好的耐受性，并且在发酵过程中应尽可 能提高益生菌数量。 当前，国内外酸奶生产多采用嗜热链球菌 （Streptococcus thermophilus）、保加利亚乳杆菌 （Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）共发 酵，这些菌株存在的局限性是不耐胃酸和胆汁，产 品益生功能有限2。植物乳杆菌能够有效耐受人体 消化系统，在肠道内大量存活，发挥调节肠道菌群 平衡，促进人体消化吸收等作用，被认为是新一代 的益生菌3-5。同时，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的一些菌株还具有降低胆固醇6-8、降 血糖9、抗菌消炎10、提高人体免疫力11等益生保 收稿日期：2014-02-27 修订日期：2014-05-04 基金项目：国家科技支撑计划项目“发酵乳制品乳酸菌菌种与发酵剂的 研究与开发”（2013BAD18B01）。 作者简介：华宝珍（1972） ，女，汉族，湖北武汉人，主要从事发酵乳制 品的研究与开发工作。上海 乳业生物技术国家重点实验室，光明乳业股 份有限公司乳业研究院，200436。Email：huabaozhen 通信作者：马成杰（1976） ，男，汉族，高级工程师，硕士，研究 方向为乳品生物技术。上海 乳业生物技术国家重点实验室，光明乳业股 份有限公司乳业研究院，200436。Email：machengjie 健功能，植物乳杆菌已成为近年来国内外研究开发 热点之一。 然而，研究表明植物乳杆菌在乳中发酵存在一 些生长限制因子，其几乎不能在乳中单独生长繁 殖、 发酵产酸。 Bringel 等12对分离的 150 株植物乳 杆菌进行分析认为，一部分植物乳杆菌为精氨酸营 养缺陷型。Chiewchankaset 等13利用基因组水平的 代谢模型对植物乳杆菌 WCFS1 等菌株的营养需求 进行了分析，也认为植物乳杆菌为营养缺陷型菌 株。因此植物乳杆菌在发酵过程中需要添加营养因 子，促进其生长繁殖。陈帅14考察了多种碳源、氮 源以及维生素等营养因子对植物乳杆菌 ST-生长 的影响，发现鱼蛋白胨能够促进其在脱脂乳中生 长。游离氨基酸和短肽是乳杆菌属菌株生长繁殖最 直接的氮源15，Saguir 等16研究发现，植物乳杆菌 对氨基酸、二肽有营养需求。植物蛋白、动物蛋白 经过蛋白酶酶解或微生物发酵可制得的短肽类物 质，在脱脂乳中添加大豆多肽等，理论上能弥补植 物乳杆菌蛋白酶活力低对牛乳蛋白的分解利用能 力的不足，促进植物乳杆菌在牛乳中的生长代谢。 Culotta 等 17研究发现在缺乏超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase, SOD） 的植物乳杆菌细胞内， 二价锰离子能与代谢产物结合形成抗氧化剂清除 过氧化物，维持细胞的正常生理功能和新陈代谢。 Sharma 等18发现二价锰离子在一些细菌体内能与 代谢产物结合形成低分子量的抗氧化复合物，有助 第 11 期 华宝珍等：植物乳杆菌 ST-脱脂乳的发酵工艺优化 277 于保护细菌体内重要酶系的活性。韩瑨等19通过向 培养基里添加营养物质制备植物乳杆菌ST-高密度 发酵液。目前，植物乳杆菌在发酵乳制品中的应用仅 限于将植物乳杆菌作为辅助菌株， 与干酪发酵剂同时 加入促进干酪风味形成20或增加产品益生功能21。 国 内外少有在脱脂乳中优化植物乳杆菌发酵条件、 制备 植物乳杆菌益生菌高含量发酵乳的研究报道。 植物乳杆菌 ST-（CGMCC No.0847）是一株 植物源益生菌，具有降低胆固醇和调节血脂等益生 功能6,22-24。本研究通过向脱脂乳中添加适量的大 豆多肽和葡萄糖酸锰，与嗜热链球菌共发酵、并改 变嗜热链球菌的接种量和发酵温度，比较不同发酵 条件下发酵乳的 pH 值和植物乳杆菌 ST-的活菌 数，利用响应面分析法优化发酵条件，提高发酵乳 中植物乳杆菌 ST-的活菌数，为拓展植物乳杆菌 ST-在乳制品领域的应用提供参考。 1 材料方法 1.1 菌种 植物乳杆菌 ST-冷冻干燥菌粉（活菌数： 1012 CFU/g）：光明乳业股份有限公司； 嗜热链球菌 Body3 冷冻干燥菌粉（活菌数：2 1011 CFU/g）：丹麦科汉森有限公司。 1.2 材料与试剂 脱脂乳粉（蛋白质质量分数 33.4%；乳糖质量 分数 54.1%；矿物质质量分数 7.9%）：新西兰恒天 然公司； 大豆多肽：大豆蛋白经蛋白酶酶解产物，分子 量为 1805 000 Da，不二富吉科技有限公司； MRS（de Man, Rogosa and Sharpe）培养基：英 国 Oxoid 公司； 其余试剂均为分析纯：上海国药集团化学试剂 有限公司。 1.3 仪器与设备 SA-300VF 高压蒸汽灭菌锅（德国 Sturdy Industrial 公司） ； MIR-253 生化培养箱 （日本 Sanyo 公司） ； Bactron-1 厌氧培养箱 （美国 Shellab 公司） ； GFL1002 恒温水浴箱（德国 GFL 公司）；868 型 pH 计（美国 Thermo Orion 公司）。 1.4 方法 1.4.1 菌种的活化 称取植物乳杆菌 ST-和嗜酸链球菌 Body3 冻 干发酵剂各 1 g，分别投放于 99 g 质量分数为 12% 的灭菌脱脂乳（9095，杀菌 120 min）中，摇 匀并充分溶解，制成接种菌液。 1.4.2 发酵乳制备工艺流程 脱脂乳粉+食品营养添加物（大豆多肽和葡萄 糖酸锰）+净化水（脱脂乳质量分数 12%）40 45溶解柠檬酸钠饱和溶液调 pH 值至 6.5 9095杀菌 90120 min冷却至 37接种 恒温发酵水浴冷却至44冷藏。 1.4.3 主要指标的测定方法 乳酸菌菌数含量的测定：采用梯度稀释平板计 数法，用 MRS 选择性培养基、厌氧培养计数发酵 乳中植物乳杆菌 ST-的含量25； pH 值测定：Orion868 pH 计测定发酵乳的 pH 值。 1.4.4 单因素试验 用质量分数为 12%的还原脱脂乳制备发酵乳， 植物乳杆菌 ST-的接种量恒定为 106 CFU/g19， 分 别考察大豆多肽的添加量、葡萄糖酸锰的添加量、 嗜热链球菌接种量和发酵温度对发酵乳的 pH 值和 植物乳杆菌 ST-活菌数的影响。 1.4.5 响应面法优化 在单因素试验的基础上，每个因素选取 3 个 水平，利用 Design Expert 8.0 进行响应面分析， 并对数据进行二次回归拟合， 得到多元回归方程， 在一定水平范围内求取最佳值，对发酵乳工艺进 行优化26-27。 1.5 数据处理方法 所有数据均平行测定 3 次， 使用 SAS 软件进行 方差显著性分析， Origin 8.0软件和Excel软件作图。 2 结果与分析 2.1 单因素试验结果与分析 2.1.1 大豆多肽的添加量对发酵乳的 pH 值和植物 乳杆菌 ST-活菌数的影响 分别向还原脱脂乳中添加质量分数为 0、 5、 10、 15、20 g/kg 的大豆多肽，以及 10 mg/kg 的葡萄糖 酸锰，接种嗜热链球菌 106 CFU/g 和植物乳杆菌 ST-106 CFU/g，37恒温发酵 48 h，测定发酵 乳的 pH 值和植物乳杆菌 ST-的活菌数， 结果如 图 1 所示。 由图 1a 可知， 添加大豆多肽对发酵乳的 pH 值 影响显著（P0.05），当脱脂乳中添加大豆多肽， 发酵乳的 pH 值显著降低，但当大豆多肽的添加质 量分数高于 5 g/kg 时，发酵乳的 pH 值不再明显变 化。这说明脱脂乳中适量添加大豆多肽有助于乳酸 菌生长代谢和产酸。由图 1b 可知，当大豆多肽的 添加质量分数低于 10 g/kg 时， 植物乳杆菌 ST-的 活菌数随大豆多肽的添加量增大而增大，当大豆多 肽的添加量继续增加时，植物乳杆菌 ST-的活菌 数几乎维持不变。通过方差分析，大豆多肽的添加 量对发酵乳中植物乳杆菌 ST-的活菌数影响显著 农业工程学报 2014 年 278 （P0.05）。大豆多肽是大豆蛋白经过蛋白酶水解 制得的短肽类混合物，植物乳杆菌 ST-能够直接 利用小分子的多肽或氨基酸进行生长代谢，弥补植 物乳杆菌 ST-蛋白酶活力低对牛乳蛋白的分解利 用能力的不足，促进菌体的生长繁殖和产酸16,19。 当大豆多肽的添加量过量时，菌体利用大豆多肽作 为营养物质已经达到极限。因此，大豆多肽的适宜 添加质量分数为 10 g/kg 左右。 注：葡萄糖酸锰添加质量分数为 10 mg/kg；嗜热链球菌接种量为 106 CFU/g；发酵温度 37。图中不同字母代表差异显著(p大豆多肽添加量葡萄糖酸锰添加量。 失拟项 P 为 0.993，没有显著性意义。模型 P 值为 0.0006，说明 此模型极显著。其决定系数为 0.9838，说明回归方 程拟合度良好，失拟较小，可以利用此模型对优化 脱脂乳体系中植物乳杆菌 ST-活菌数进行分析和 预测。 表 2 Box-Behnken 试验设计及结果 Table 2 Box-Behnken design and corresponding results for response aurface analysis 试验号 Test number 大豆多肽添 加质量分数 X1 Soybean polypeptide concentration 葡萄糖酸锰 添加质量分 数 X2 Manganese gluconate concentration 嗜热链球菌 接种量 X3 Inoculum size of S. thermophilus 植物乳杆菌 ST-活菌数 Living cell count of L.plantarum ST-/ (108CFUmL-1) 1 1 0 1 12.85 2 -1 1 0 10.25 3 -1 0 -1 8.35 4 0 0 0 17.33 5 -1 -1 0 15.05 6 0 1 -1 10.02 7 1 0 -1 8.08 8 0 0 0 18.95 9 -1 0 1 8.89 10 0 1 1 12.48 11 1 -1 0 11.52 12 0 0 0 19.86 13 1 1 0 16.88 14 0 -1 -1 10.11 15 0 -1 1 12.31 第 11 期 华宝珍等：植物乳杆菌 ST-脱脂乳的发酵工艺优化 281 表 3 回归方程方差分析及显著性检验 Table 3 Analysis of variance and significance tests for fitted regression equation 方差来源 Source 自由度 Df 总平方和 Sum of squares 均方 Mean square F 值 F value P 值 P value 显著性 Significance 模型 Model 9 207.25 23.03 33.77 0.0006 * X1 1 5.76 5.76 8.45 0.0335 * X2 1 0.051 0.051 0.075 0.7950 NS X3 1 12.43 12.43 18.22 0.0079 * X1X2 1 25.81 25.81 37.84 0.0017 * X1X3 1 4.47 4.47 6.56 0.0506 NS X2X3 1 0.017 0.017 0.025 0.8811 NS X12 1 44.92 44.92 65.87 0.0005 * X22 1 11.97 11.97 17.55 0.0086 * X32 1 119.25 119.25 174.87 葡萄糖酸锰添加量，发酵温度对 植物乳杆菌 ST-的活菌数影响不显著。 2）优化的工艺参数为：大豆多肽的最佳添加 质量分数 11 g/kg；葡萄糖酸锰添加质量分数 11 mg/kg；嗜热链球菌的接种量 106 CFU/g；植物乳 杆菌 ST-的接种量 106 CFU/g；发酵温度为 37。 在此优化最佳工艺条件下，发酵乳的植物乳杆菌 ST-的活菌数为 1.88109 CFU/mL， 发酵乳凝乳状 态均匀，风味浓厚纯正。 3）通过响应面优化法得到的最佳工艺条件， 为工业化生产高活菌数的植物乳杆菌发酵乳提供 技术支持。 参 考 文 献 1 Vasiljevic T, Shah N P. 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