「大肠杆菌培养操作规程」.doc

大肠杆菌培养操作规程一、 目的及适用范围制订本规程的目的为规范大肠杆菌总RNA的制备，保证为诊断试剂产品提供质量可控的质控品及标准品基质。本规程适用于南京实验室提取大肠杆菌总RNA的操作。依照本操作规程，每次可提前大约提取基质液原液2.7ml。二、 常规时间安排预计安排步骤耗时评估第一天耗材准备20minPBS储存液配置40min培养基配制20min灭菌3h领取菌种10min第二天菌种复苏9h接种40min分装培养13hRNA完全提取根据需求，自行安排。三、 培养用耗材准备1、 锥形瓶、双层铝箔、棉绳2、 包扎一盒1ml的枪头，50ml康宁冻存管四、 培养基配制(早上) 培养基应现配现用，每次配置350ml，一次性使用完毕。1、 按下表称取物资配置LB培养基到500ml锥形瓶中：例如：配制350mlLB培养基配方如下：配置双份成分名称蛋白胨TRYPTONE氯化钠酵母提取物YEAST XTRACT去离子水称取质量3.5g3.5g1.75g补足350ml2、 用双层铝箔和棉绳对锥形瓶进行封口，摇晃锥形瓶以使各物质迅速、均匀、完全、溶解。待灭菌。五、 PBS溶液配制1、 10XPBS不需要每次生产都配置，生产前跟检查PBS量是否充足，如充足则可跳过该步骤。2、 配制10XPBS缓冲液备用；例如配制1000L10XPBS储存液，取1000ml配液瓶，根据下表称取各物质。用去离子水定容至1000ml。名称称取量浓度10XH2O1000mlNaCl80.0gKCl2.0gNa2HPO414.4gKH2PO42.4g3、 将PBS溶液混合均匀，包扎好，待灭菌。六、 灭菌1、 将配置好的PBS溶液，培养基，1ml枪头准备好。2、 确认灭菌锅内水位是否达到标准水位，若未达到，则加入纯化水至标准水位。3、 将包扎好的培养基、PBS溶液和枪头盒一同放入灭菌锅。注意PBS盖不可太紧，盖紧灭菌锅盖，须旋紧；设置各参数：121，20min。4、 灭菌结束后，待灭菌锅压力降至“0”，打开灭菌锅盖；取出灭好菌的培养基和枪头盒。5、 PBS、培养基放置于室温静置2h，待完全冷却。枪头盒放入80C鼓风干燥箱三小时烘干。备用。6、 冷却至室温后，进行活化。七、 菌种复苏（下班前）1、 打开超净工作台紫外灯，紫外照射半小时，关闭紫外灯。2、 在超净工作台内进行菌种复苏接种操作，打开50ml冻存管管盖后，用酒精灯外焰灼烧灭菌处理冻存管管口，打开处理好的培养基瓶，用酒精灯外焰灼烧灭菌处理培养基瓶瓶口，倒10ml培养基至50ml冻存管中，用酒精灯外焰灼烧灭菌处理培养基瓶瓶口后将培养基瓶密封待用。03、 吸取400L菌种到已加培养基的50ml冻存管中，用酒精灯外焰灼烧灭菌处理冻存管管口后盖好冻存管管盖，震荡混合均匀。4、 标记冻存管，并培养：恒温培箱，恒温培养8h，设置参数：37，220r/min。八、 接种（第二天早上）1、 提前半小时打开超净工作台紫外灯，紫外照射半小时，关闭紫外灯。2、 在超净工作台内进行接种操作，在开盖后及封盖前均须将瓶口或管口用酒精灯灼烧灭菌处理。3、 接种量为：1:100。例如：300ml培养基，取出DH5菌种瓶，打开后用酒精灯外焰旋转焰灼烧瓶口灭菌，吸取3ml DH5菌种加入到培养基中，用酒精灯外焰旋转灼烧菌种瓶口灭菌后盖好盖子，用酒精灯外焰旋转灼烧培养基瓶口灭菌后盖好盖子，摇匀接种后的培养基。4、 接种