分子生物讲义：第七章 分子生物学常用技术.ppt

分子生物学常用技术,第一节 凝胶电泳,带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳（electrophoresis）。 电泳技术主要用于分离各种有机物（如氨基酸、多肽、蛋白质、酶、脂类、核苷、核苷酸、核酸等）和无机盐，也可用于分析某种物质的纯度及分子量的测定等。 电泳技术在分子生物学领域应用非常广泛，特别是以琼脂糖和聚丙烯酰胺为支持介质的凝胶电泳，以操作简便、快速、灵敏、分离范围广等优点成为分离、纯化、分析和鉴定核酸的主要手段。,一、琼脂糖凝胶电泳,（一）原理 核酸分子是两性解离分子。在ph3.5时，碱基上的氨基基团解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，整个核酸分子带正电荷；在ph 8.08.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电荷。若将由ph8.0电泳缓冲液制成的凝胶置于电场中，核酸分子由于带负电荷会向正极泳动。不同大小和构象的核酸分子由于所受到来自电场的驱动力和来自凝胶分子筛网孔的阻力差异，具有不同的迁移率。,（二）操作要点,1琼脂糖的选择 琼脂糖是一种从海洋植物琼脂中提取出来的长链状多聚物。一般琼脂糖在溶液中加热到80900c熔化，形成清亮、透明的液体，浇在模具上冷却后固化形成凝胶，是一种理想的电泳支持物 .不同的琼脂糖产品在纯度、熔解温度以及成胶后的机械强度等特性上有较大差异。使用者可以根据研究需要选择不同类型的产品.,（1）低熔点琼脂糖：这类琼脂糖由于在糖链上引入羟乙基，熔点降低，熔化温度 700c，低于双链dna的变性温度，故利于dna的回收，但这种凝胶的分辨率及机械强度较差.,（2）高纯或超纯琼脂糖：一般琼脂糖中常含有其他多糖、盐及蛋白质等杂质，这些杂质往往会对dna、rna片段的酶切、标记或进一步克隆有干扰。另外，高纯度琼脂糖凝胶强度较高，不易破碎.,（3）高筛分琼脂糖：一般琼脂糖的孔径较大，对1000bp以下的分子分离效果较差。新近生产的高筛分琼脂糖具有高分辨率及高强度等优点，能区分相差4个碱基的dna片段，除可用于rcr产物的分析外，还能用于基因分型、四核苷酸重复序列分析等。,2凝胶浓度的选择 琼脂糖一般用于分离20050000bp的dna片段。凝胶浓度不同，分辨dna大小的范围不同。根据需要分离的核酸分子的大小选择合适的凝胶浓度，即可达到理想的分离效果。,表17-1 不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围,3dna分子量标准,通常采用已确定核苷酸序列的噬菌体或质粒dna，经限制性核酸内切酶完全水解，然后用所获得的特定大小的酶切片段作为dna凝胶电泳的分子量标准（dna marker）。 由于线状双链dna分子泳动距离与分子量的对数成反比，若以已知片段大小的dna分子的泳动距离为横坐标，分子量为纵坐标，即可绘出可以确定dna分子量的标准曲线,琼制糖凝胶电泳常用的dna分子量标准,4琼脂糖凝胶电泳缓冲液,缓冲液有用于双链dna电泳，ph为8.0的tris-乙酸（tae）、tris-硼酸（tbe）或tris-磷酸（tpe）缓冲液，和用于变性单链dna的碱性电泳缓冲液（ph8.0，含50mmol/l naoh，1mmol/l edta）。 tae的缓冲能力较差，长时间电泳后会使其缓冲容量消失，使阳极变为碱性，阴极变为酸性，故需及时更换缓冲液。tbe和tpe的缓冲能力较强，可重复使用数次。 碱性缓冲液不能直接用于熔化凝胶，因为naoh加入热琼脂糖溶液后会引起多糖水解。制胶时应先用蒸馏水溶解琼脂糖，在倒胶前再加入碱性缓冲液。,5样品制备,琼脂糖凝胶电泳通常是将凝胶板全部浸入电泳缓冲液中，以“潜水电泳”的方式进行。 为了不使样品在电泳槽缓冲液中上漂并指示电泳的距离，常在制备好的dna样品中加入含有蔗糖或甘油以及指示剂（溴酚蓝、二甲苯青等）的上样缓冲液。 样品中含盐量不能太高，否则电泳中会出现区带消失、前沿不齐等现象。样品中dna含量以每条区带的dna不少于0.1g为宜。dna浓度亦不能过高，否则会使电泳区带变宽，泳动距离异常。样品的用量由加样孔的体积决定，通常为1050l。,6电泳条件 dna琼脂糖凝胶电泳通常采用12v/cm凝胶（低压电泳）、810v/cm（中压电泳）或几十伏以上/cm（高压电泳）的电压降进行恒压电泳。电泳时间可根据指示剂的迁移位置确定。电泳温度以1525为宜。,7dna电泳染色,dna电泳采用荧光染料溴乙锭（eb）染色。溴乙锭能与dna结合，嵌入配对碱基之间，在紫外光照射下，dna区带发出红色荧光，根据荧光可以确定dna在凝胶中的位置。使用时将溴乙锭直接加入凝胶液中，使其终浓度为0.5g/ml，或于电泳完毕后，将电泳凝胶浸入含0.5g/ml溴乙锭的溶液中，染色3045分钟后，即可在紫外灯下观察、拍照。,8dna片段的回收,dna分子经过凝胶电泳分离后，常常需要从凝胶中回收dna。电泳完毕后可在紫外灯下切下拟回收的dna区带，常用的方法有 ：,（1）低熔点琼脂糖法,采用低熔点琼脂糖制备的电泳凝胶，电泳完毕后可在紫外灯下切下拟回收的dna区带，于650c保温1020分钟使胶条熔化后，再用酚 - 氯仿抽提，最后用95%冷乙醇沉淀抽提的dna片段，本法回收率可达80%。 本法的优点是可直接在熔化的凝胶中进行各种酶反应，如合成放射性核素探针，进行限制性酶切割等，但操作时需严格控制熔胶及电泳温度，应分别65及30。,（2）透析袋电洗脱法,电泳完毕后，于紫外灯下切下拟回收的dna区带，将凝胶条置于含有适量缓冲液的透析袋中，再放入电泳槽电泳3060分钟（610v/cm），使dna分子泳动到透析袋靠正极一侧的壁上，然后反向电泳3060秒，使粘在透析膜上的dna分子泳动到袋ph为8.0内的缓冲液中。吸出袋内的缓冲液并用正丁醇抽提或乙醇沉淀所需的dna分子。 本法适用于分子量较小的dna片段的回收。,（3）deae- 纤维素膜法,用琼脂糖凝胶电泳将dna片段分离后，于紫外灯下在紧靠待回收dna片段前方切一裂隙，将条状deae-纤维素膜插入裂隙中，继续电泳至袋中所有的dna均转移到膜上。再用低离子强度的缓冲液洗掉膜中杂质，然后在高离子强度的缓冲液中将dna洗脱下来，最后用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀dna分子。 本法适用于小于5kb的双链dna分子的回收，回收的dna纯度很高。,（三）琼脂糖凝胶电泳应用范围,琼脂糖凝胶电泳主要用于dna的分离、纯化和鉴定，如用于重组基因的分离、鉴定、限制性酶切图谱分析、southern、northern、western杂交分析，以及pcr产物的分离鉴定等等。几乎所有分子生物学研究工作都离不开凝胶电泳这一最基本的实验技术 。,二、聚丙烯酰胺凝胶电泳,（一）原理,聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（acr）在催化剂n,n,n,n四甲基乙二胺（temed）和过硫酸铵（ap）的作用下，发生聚合反应，形成含有亲水性酰胺基侧链的脂肪族长链，链间通过交联剂n,n亚甲双丙烯酰胺（bis）交叉连接最终形成具有三维网状结构的凝胶。凝胶网孔的大小取决于聚合链的长度及交联度。聚合链的长度决定于聚合反应中单体丙稀酰胺的浓度，交联度则决定于单体与交联剂的相对比例，其中交联剂浓度愈高，形成凝胶的孔径愈小。因此，通过控制单体浓度及单体与交联剂的比例，制备孔径大小不同的凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶电泳既有分子筛效应，又有电荷效应。因此可根据电泳样品的分子大小、电荷多少及形状的差别分离核酸片段。它特别适用于寡聚核苷酸分离和dna序列测定。,（二）操作要点,1非变性聚丙烯酰胺凝胶,非变性聚丙烯酰胺凝主要用于分离和纯化双链dna分子。 这种凝胶常用tbe配制，并且为防止电流通过时产生的热量引起dna变性，常以低电压（18v/cm）进行电泳。 双链dna分子在未变性的聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率除与其分子大小有关外，还受碱基组成和序列的影响。同等大小的dna分子可能由于空间结构的不同而迁移率相差10，故由此确定的dna片段大小会不够精确。,2、变性聚丙烯酰胺凝胶,变性聚丙烯酰胺凝胶主要用于分离和纯化单链dna片段。这种凝胶在核苷酸碱基配对抑制剂，如尿素、甲酰胺或十二烷基磺酸钠（sds）存在的情况下聚合而成。dna在其中的迁移率与碱基的组成及排列顺序无关，可用于探针分离、s1核酸酶解产物分析和dna序列测定,3凝胶浓度的选择,聚丙烯酰胺凝胶一般用于分离5500bp的dna片段，不同浓度凝胶的分离范围 。,不同浓度非变性聚丙烯酰胺凝胶的分离范围,不同浓度变性聚丙烯酰胺凝胶对寡核苷酸的分离范围,4凝胶中dna的检测,（1）溴乙锭染色法,将电泳后的凝胶置于0.5g/ml的溴乙锭染液中染色3045分钟，再用紫外灯观察、照像。由于聚丙烯酰胺能淬灭溴乙锭的荧光，故不能检出10ng以下的dna带。,（2）银盐染色法,ag+能与凝胶中的核酸分子形成稳定复合物，用甲醛使复合物中的ag+还原成银颗粒后，凝胶中的单链、双链dna或rna即被染成黑褐色。 操作时先将电泳凝胶在含有甲醇、乙酸的溶液中浸泡并用戊二醛固定，再将凝胶浸泡于硝酸银溶液中，然后用含有甲醛的碳酸钠溶液显影，直到获得满意效果。 本法的灵敏度比溴乙锭染色法高200倍左右，能检测出0.5ng的rna。但是银对dna有破坏作用，银染的dna片段不宜回收。,（3）放射自显影法,如果聚丙烯酰胺凝胶分离的dna含有放射性，可通过放射自显影进行检测。凝胶与x线片一起密封曝光、显影、定影，x线片即可在相应位置显示放射性dna的区带。,5dna片段的回收,压碎浸泡法：电泳完毕后，于紫外灯下切取拟回收的dna区带，将凝胶条放入ep管中，用玻棒捣碎后，加入洗脱缓冲液，于37下轻摇数小时，离心并吸取上清、再向ep管中加入洗脱缓冲液，混匀后再离心，合并两部分上清，反复用乙醇沉淀和用氯仿异戊醇抽提，即可得到所需的dna分子。本法适用于从3.5%5聚丙烯酰胺凝胶中回收分子量1kb的dna片段。回收的dna纯度很高，但回收率较低。 此外，还可将含有需回收dna片段的聚丙烯酰胺凝胶块埋在琼脂糖凝胶的裂隙中，然后用deae纤维素膜法回收dna。,（三）聚丙烯酰胺凝胶优点,(1)机械强度好、弹性大、化学稳定性高；(2)分辨率高，长度相差仅1个bp的dna分子可以通过聚丙烯酰胺凝胶有效地分离；(3)载样容量大，在1cm1mm的标准样品槽中可加入多达10g的dna样品，而不影响电泳分辨率；(4)dna抽提纯度高，电泳后dna抽提物几乎不用任何处理即可进行下一步操作 。,（四）应用范围,聚丙烯酰胺凝胶电泳除了主要用于rna和小分子dna的分离、纯化和鉴定外，还常用于dna的序列分析、克隆基因表达蛋白质的检测与分析等。,第二节 分子杂交,分子杂交技术是分子生物学领域应用最为广泛的技术之一，具有灵敏度高、特异性强等优点，在分子克隆、基因诊断、核酸结构分析以及蛋白质结构、功能的研究中具有重要作用 。,一、分子杂交的基本原理,核酸分子杂交是在核酸变性及复性原理基础上建立的实验技术，是指具有一定同源序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基互补原则退火形成异质双链的过程。,二、分子杂交的分类,根据监测核酸种类及手段的不同主要分为原位杂交（in situ hybridization）、斑点杂交（dot hybridization）、southern杂交和northern杂交。 根据反应介质的不同又可分为：待测核酸序列与探针均游离在溶液中进行杂交的液相杂交，和将待测核酸分子结合到固相支持物上与游离在溶液中的探针进行杂交的固相杂交。 除核酸分子杂交外，还有以抗原-抗体及受体-配体特异结合反应为特征的western杂交。,三、分子探针的标记,分子探针是能特异检测靶分子（待测核酸或蛋白质）的活性物质。 分子探针除了能与靶分子特异结合以外还必须用放射性核素或其他活性物质标记，使待测物质在很低的浓度下被检测出来。 探针在标记后应不改变探针分子的理化特性，不影响探针与靶分子的特异结合，同时检测的方法要求简便、灵敏、特异。 常用的探针标记物有两类：放射性核素和非放射性核素标记物。,（一）放射性核素标记,放射性核素是目前最常用的探针标记物，它不影响探针与靶分子的特异结合，而且检测灵敏度高，可以检测到10-1410-18g的物质。标记探针的放射性核素主要有32p、3h、35s以及131i、125i、14c等。,（二）非放射性核素标记,放射性核素标记物具有安全可靠的优点。常用的有生物素、地高辛、荧光素如罗丹明和一些酶类如碱性磷酸酶等。,（三）dna缺口平移标记法,双链dna分子在极微量的dna酶i（dnase i）的作用下，可在一条链上碎机切开若干个切口，然后利用dna聚合酶i具有的5- 3外切核酸酶的特性，逐个切除切口5端游离的核苷酸。再利用dna聚合酶i的聚合特性，在切口的3oh端逐个加入新的核苷酸。这样3端核苷酸的加入和5端核苷酸的切除同时进行，导致切口沿着dna链移动，故称为缺口平移。 由于反应底物中含有标记的核苷酸，所以，缺口平移实际上是标记的核苷酸取代原dna链中同种核苷酸的过程。 由于原来双链dna是随机切口，所以生成的两条链都被放射性核素均匀的标记上，而且标记的dna有较高的放射比活性。,二. 分子探针的标记,1. dna 缺口平移,5,3,双链dna,datp dctp dgtp - 32pdttp,*t,*t,3,5,*t,*t,*t,*t,3,3,3,3,3,3,5,5,5,5,5,5,14,5,3,dna酶,大肠杆菌dna聚合酶（全酶）,mg2+,（四）随机引物标记法,dna的六聚寡核苷酸混合物在较低的退火温度下，能与各种单链dna模板结合。双股探针dna片断经煮沸变性形成单链dna分子，六聚核苷酸引物随机结合在单链dna分子上，然后在dna聚合酶i klenow作用下，从六聚核苷酸引物的3端开始，按照5- 3方向，遵循碱基互补的原则合成一新的dna链。 由于合成反应的底物中含有标记的核苷酸，新合成的dna链上也就被标记。用本法标记的dna探针或cdna探针比活性显著高于缺口平移法，而且效果较稳定。,（五）dna的5末段标记,待标记的dna片断先用小牛肠碱性磷酸酶切除5末端的磷酸基团，再用t4核苷酸激酶将 32 p中的32p-(磷酸集团)转移至dna的5- oh末端。反应如下： 5 pcpgpcptpa 3 碱性磷酸酶 5 ho - pcpgpcptpa 3 32 patp t4多核苷酸激酶 5 32 pcpgpcptpa 3 本法适用于寡核苷酸探针或短的dna和rna探针的标记。,三、分子探针的类型,（一）基因组dna探针,这类探针多采用分子克隆或pcr技术从基因文库筛选或扩增方法制备。由于真核生物基因组中存在高度重复序列，制备探针应尽可能选用基因的编码序列（外显子），避免选用内含子及其他非编码序列，否则将引起非特异性杂交而出现假阳性结果。,（二）cdna探针,cdna是以rna为模板，在反转录酶的作用下合成的互补dna，因此它不含有内含子及其他非编码序列，是一种较理想的核酸探针。,（三）rna探针,mrna探针为单链分子，分子内无高度重复序列，与待测序列的杂交效率高、特异性强。此外，杂交后用rna酶（rnase）可将未杂交的探针分子水解，使杂交本底降低，因此，也是一种较为理想的核酸探针。但是rna容易降解、标记困难，使其应用受到限制。,（四）寡核苷酸探针,这类探针可以用人工合成的方法制备。由于其分子量小、序列复杂性低、不含高度重复序列，因此杂交所需时间短，特异性强。并且由于其制备比较方便，在核酸分子杂交中的应用愈来愈广泛。,（五）蛋白质或多肽探针,适用于蛋白质免疫印迹杂交的探针，常常是待检测蛋白质的抗体，可用放射性核素或非放射性标记物如酶等进行标记。,四、原位杂交（1）,原位杂交是用标记的已知顺序核酸作为探针，在原位检测细胞或组织切片内特定核酸序列的方法。 原位杂交根据其检测物的不同可分为细胞内原位杂交和组织切片原位杂交。 基本程序为：细胞或组织固定预杂交杂交冲洗放射自显影或标记酶显色反应分析结果。,原位杂交（2）,通过与细胞内rna的杂交观察某个特定基因在该组织细胞中的表达水平； 通过染色体dna杂交研究染色体中特定核酸序列的精确定位； 使用核酸探针通过菌落杂交筛选阳性克隆； 用特异性的病毒、细菌的核酸作为探针与组织或细胞杂交，诊断受试者有无该病原体的感染。,五、斑点杂交,斑点杂交是将核酸（dna或rna）直接点在纤维膜上，再与探针进行杂交的实验技术。测定时用已知含量的核酸杂交斑点绘制标准曲线，通过纤维膜杂交斑点的放射性脉冲数或放射自显影胶片斑点的光吸收值扫描可以测定待检核酸的含量。,六、southern杂交,southern杂交是由southern于1975年建立的，是经电泳分离的dna片段转移至固相支持物上再与核酸探针杂交的一种dna杂交技术。,（一）dna片段的转移,1毛细管转移法 转移缓冲液通过滤纸的毛细管上升，形成由下至上的液体流，凝胶上的dna片段即由液流携带而转移到薄膜上，由于薄膜具有吸附作用，dna就被固定在膜上。转移的速度由dna片段的大小和凝胶中dna片段的浓度决定。 2电转移法 是利用电场作用将凝胶中的dna转移到固相支持物上的一种快速、高效的转移方法。 3真空转移法 是近年发展起来的利用真空作用将转移缓冲液从上层容器中通过凝胶进入下层真空室中，同时带动核酸片段转移到固相支持物上的一种转移方法。,（二）southern杂交的基本程序,限制性核酸内切酶消化dna琼脂糖凝胶电泳分离dna片段dna变性并转印到固相支持物上固定（80，2小时）预杂交及杂交放射自显影读片，分析结果。,（三）southern杂交的应用范围,southern杂交主要用于基因组基因的定性及定量分析、组建dna物理图谱、研究基因重排、变异以及基因的限制性内切酶酶切片段长度多态性分析（rflp），也广泛用于疾病诊断。,七、northern杂交,northern杂交是指细胞总rna或mrna，经变性、电泳分离，再转移到固相支持物上与探针杂交的实验技术。其基本程序与southern杂交相同。northern杂交主要用于观测各种基因转录产物的大小，转录量以及转录产物的特性。,八、western杂交,western杂交是toubin等于1975年建立的蛋白质免疫印迹杂交，原理与southern及northern杂交技术相类似，区别在于探针往往是待测蛋白质的相应抗体。 western杂交的基本过程是：待测样品经过sds聚丙烯酰胺凝胶电泳后被转移到固相支持物上，再与抗体探针发生免疫学结合，通过放射自显影或标记的酶反应对靶蛋白进行定性、定量分析。免疫印迹试验常采用标记第二抗体的间接免疫检测反应，不用逐一标记第一抗体，试验简便易行。,第三节 聚合酶链反应（pcr）技术,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, pcr）扩增技术，即试管内dna的扩增，以其显著的三大特点即特异性、高效率和忠实性，在生命科学研究领域产生了巨大影响。自1983年美国pecetus公司mullis等人发明该技术至今，已从最初的手工操作，完成了自动化操作，并以极快的速度增加了该技术的应用。这一技术极大地推动了分子生物学及其相关学科的发展，并已迅速在其它领域得以应用，成为核酸分子水平研究的基础及最为广泛应用的技术。,一、pcr基本原理和影响因素,（一）基本原理,pcr技术实际上是在模板dna，引物和4种脱氧核糖核苷三磷酸存在的条件下依赖于dna聚合酶的酶促合成反应。pcr技术的特异性取决于引物和模板dna结合的特异性。 pcr全过程包括三个基本步骤，即双链dna模板加热变性成单链（变性）；在低温下引物与单链dna互补配对（退火）；在适宜温度下taq dna聚合酶催化引物沿着模板dna延伸（延伸）。这三个基本步骤构成的循环重复进行，可以使特异性dna的扩增率达到数百万倍（2106）。,（二）pcr各步骤简介,pcr扩增一个模板，要求一对寡核苷酸引物，4种脱氧核糖核苷三磷酸（dntp）、摩尔数超过dntp的镁离子和进行dna合成的taq dna聚合酶。 1变性 加热至9096时，使模板dna双螺旋的氢键断裂，双链解链，形成单链dna。 2退火 当温度降低至2565，使引物与其互补的单链dna模板在局部形成杂交链。 3延伸 7074下，在taq dna聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及mg2+存在的条件下，以引物为起始点沿着互补的单链模板进行dna链延伸反应。,（三）pcr操作程序,向0.5ml无菌eppendorf管内依次加入： （1）10扩增缓冲液：1/10体积。 （2）4dntp： 各200mmol/l。 （3）引物1： 1mmol/l。 （4）引物2： 1mmol/l。 （5）dna模板： 102-105拷贝。 （6）ddh2o： 补至终体积（终体积可为25100l）。 （7）混匀后，离心10秒，使反应成分集于管底，95变性10分钟，taq聚合酶2.02.5u（100l），离心混匀。 （8）矿物油： 100l。 2变性90-96 30-60秒。 3退火25-65 60-90秒。 4延伸70-74 30-60秒。 5重复(2)(4)2535次。每次即为一个pcr循环，最后一个循环72增加5分钟，迅速冷却。 6琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr扩增产物。,（四）pcr 注意事项,1模板,pcr反应的模板可以是dna，也可以是rna，后者的扩增需首先逆转录成cdna后才能进行正常pcr循环。 不同来源的核酸标本，如临床标本（血液、痰液、尿液、粪便、体腔积液）、法医学标本（血斑、毛发、精斑等）、病理 标本（如组织学）以及考古标本等，可以选用不同的方法直接提取dna。无论标本来源如何， 扩增核酸均需要部分纯化，操作过程应避免dna的降解，并尽量使核酸标本中不含蛋白酶、核酸酶，特别是taq dna聚合酶抑制剂。,2引物,引物的选择是整个pcr扩增反应成功的关键因素之一。理想的引物应该有效地与靶序列杂交，而不与模板其它序列杂交。,（1）引物合成的质量,合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析（hplc）纯化，以减少发生非特异扩增和信号强度的降低，冻干引物可以在常温下运输。冻干引物于20可以保存1224个月，甚至更长，液体状态于20可以保存6个月或更长。,（2）引物长度,特异性一般通过引物长度和退火温度控制。寡核苷酸引物长度一般为1530bp。这些寡核苷酸引物适于序列无变异，靶位确定的标准pcr。引物长度增加，能提高特异性，但是在扩增退火时被引发的模板会减少，而降低反应效率。 实际应用中最适延伸温度不要超过taq dna聚合酶的最适温度（74），这样才能保证酶活性和产物特异性。,（3）引物的3末端和5末端核苷酸,引物3末端是pcr延伸的起始端，不能进行任何修饰，避免二级结构的形成，一般3端也不能发生错配。 引物5端仅起限定pcr产物长度，它对扩增特异性影响不大，可以被修饰而不影响扩增的特异性。,（4）引物gc的合理含量,一对引物的gc含量和tm值应该协调，g+c含量一般为4060%，如含有50%的g+c各20个碱基的寡核苷酸链的tm值大概在5662范围内，根据公式tm=4（g+c）+2（a+t），可估计引物tm值，tm值最好接近72，使变性条件最佳。,（5）避免引物自身和引物之间的互补,引物自身和引物之间均应避免互补序列，尤应避免3端的互补重叠。一般来讲，单个引物自身连续互补碱基不能超过3bp，一对引物间也不宜多于4个连续碱基的互补。,（6）引物碱基的随机分布,选择模板中缺乏某种单一核苷酸的区域设计引物，可以减少广范围引物同源的机会。同时，也要注意引物对在长度和碱基组成上的平衡，使两个引物的tm值相差在23范围内。,（7）避开产物的二级结构区设计引物,采用计算机软件可以预测估计mrna的稳定二级结构，有助于选择模板。,（8）使用引物设计软件,现在引物设计与合成已商品化，有可免费提供的计算机程序设计服务。在对所研究基因组全部序列并不完全知道的情况下，这些程序既方便又实用，但是即使是最好的程序也并非完美无缺。 使用计算机软件时，选择参数设置的越多，计算机需要考虑的情况越多，寻找引物所需的时间会越长。因此，在实验设计上明确限定参数应尽可能狭窄和独特，这样可以得到快速和高质量的引物设计。,（9）引物浓度,两条引物一般各在0.10.5mmol/l，浓度太高会引起错配及非特异性产物扩增，且可增加引物之间形成二聚体的几率及造成浪费，太低则可能达不到扩增效果或产量太低。,3循环温度和时间,变性温度一般在90-96，在此温度既能使dna双链模板变性，又能保持taq dna聚合酶活力。如果实验温度低于90-96，则dna变性不完全并容易复性而减少扩增产量。 退火温度必须严格规定，可根据公式tm=4（g+c）+2（a+t）进行计算，退火温度太低易出现非特异性扩增。一般退火温度应低于tm值5。退火温度的范围一般在2565之间。 延伸温度常用70-74，延伸30-60秒，时间可根据扩增dna的长度而定。 循环次数的确定，以既达到扩增效果又尽量减少非特异性产物的扩增为原则，一般在2035次，循环次数过多将增加非特异产物。,4taq酶浓度,taq酶在反应体系中的终浓度常为2-2.5u/100ul。 酶量过少合成产物量低，酶量过高则非特异性产物随之增加。,5镁离子(mg2+)浓度,mg2+浓度对pcr产物的特异性和产量影响明显，特别是对taq酶的影响尤为明显。过量的mg2+会导致酶催化非特异产物的扩增，而mg2+浓度过低，又会使taq酶的催化活性降低。一般mg2+浓度在0.52.5mmol/l之间。,6. 脱氧核苷三磷酸浓度,4种dntp（datp、dctp、dgtp、dttp）在反应中浓度相等，一般为200mol/l。浓度过高会抑制taq酶活性，且引起taq酶催化错配。,（六） pcr条件优化,pcr扩增大量目的产物是理想的结果，但在未找到最佳扩增条件时可能产生许多不需要的非特异性产物或没有扩增到任何产物。这就需要对pcr条件进行优化，以达到预期的扩增目的。,（1）有利于增加特异性的条件,如降低mg2+浓度，降低dntp浓度，优化ph，降低taq酶用量，减少循环中各部分的时间或循环数，增加退火温度，减少或去除抑制剂以及纯化dna模板等。,（2）加入或优化增强剂,加入一系列辅助物如dmso（1%10%）、peg6000（5%15%，甘油5%20%）、非离子去污剂、甲酰胺（1.25%10%）和牛血清白蛋白（10100mg/ml）到反应体系中可以提高特异性和产量。,（3）优化引物设计,借助于计算机引物设计软件来达到引物的优化。,（4）热启动技术,在pcr反应的第一个循环中待温度升高超过模板tm值80后才加一两种关键试剂。例如反应体系中先不加入taq dna聚合酶，而到第一个循环的变性阶段温度超过80以后再加，这样，可以大大减少引物二聚体和非特异性配对的形成，提高pcr反应的特异性。 还可利用石腊将需要后加的成份与反应液隔开，当加热至石蜡被融化后，上面的后加成分即进入反应体系； 还有利用加入抗taq dna聚合酶的单克隆抗体于pcr反应管中，当温度升高到将中和抗体变性失活之前，抗体阻遏taq酶活性，防止反应开始。,（5）降落pcr（touchdown pcr, tdpcr）,降落pcr是连续改变反应管退火温度，以找到最佳扩增条件的方法。开始的退火温度选择为高于估计的tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到tm值，并最终低于这个水平。tdpcr最有利于第一个引物与其互补序列结合和扩增产物的生成。当目的扩增产物已开始几何扩增时，既使剩下循环的退火温度最终降到非特异杂交的tm值，此时目的产物的扩增已经处于非常优势的地位。一般在编设td-pcr程序时，退火温度的范围应该超过15，从高于tm值几度降到低于它10左右。,二、反转录pcr技术,反转录pcr（reverse transcription pcr, rt-pcr）是以rna为起始模板产生cdna，再以cdna为模板进行pcr扩增，而获取目的基因或检测基因表达。 rt-pcr主要用途：直接从总rna或mrna分离获取目的基因，合成cdna探针，构建rna高效转录系统。,（一） rt-pcr方法,1mrna反转录产生cdna第一链,10扩增缓冲液 2l 4种dtnp（每种浓度10mmol/l） 2l 下游引物（与cdna第一链互补的引物） 1g rna酶抑制剂 20u mrna 1-2g amv逆转录酶 20u 加depc处理水或三蒸水至20l，充分混匀，于42，反应30-60分钟,2灭活反转录酶,于95加热5-10分钟，灭活反转录酶，使rna-cdna杂交体变性，然后迅速冰浴冷却。,3pcr扩增,依次加入： 10pcr缓冲液 5l “上游”引物（与初始mrna互补引物） 0.2-1mol/l “下游”引物（与cdna互补引物） 0.2-1mol/l 上述扩增转录产物 10l taq dna聚合酶 2.5u 去离子水或三蒸水 50l 混匀后短暂离心 加100l矿物油 在适当的温度及时间参数下扩增30-35循环，末次循环后延伸5-7分钟。,4 凝胶电泳鉴定,取扩增产物5-10l，于琼脂糖或聚丙烯酸酰胺凝胶电泳，eb染色鉴定pcr扩增产物。,（二） ） rt-pcr 注意事项,1组织或细胞样本的选择,需注意并不是每种组织或细胞都表达所有的基因，即某些基因的mrna不存在于组织或细胞中，因此，确定所选用的材料中是否含有所需扩增的基因模板是实验成败的关键。,2引物,合成cdna第一条链时，引物可用随机6聚核苷酸，或下游引物，或poly-（dt），其中以6聚核苷酸的随机引物效果最好。,3反转录酶,不同来源的反转录酶均可较好地用于第一链cdna的合成，其合成受不同rna模板的影响。提高反转录温度（55）、增加1-3倍的酶量可克服rna二级结构的影响。,4cdna反应产物,cdna第一链中的rna模板不影响pcr反应，无需用碱或rnase处理去除。没有必要将cdna反应产物全部用于pcr，用其1/10-1/25即可。,5避免rna酶污染,检测rna时，使用的试管和能耐高压的试剂必经经高压灭菌处理，同时使用rna酶抑制剂，而且在操作时应戴一次性手套以防污染。,三、pcr-sscp银染技术,聚合酶链式反应单链构象多态性分析（single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products, pcr-sscp），是由orita等1989年发展起来的一种基因分析新方法。该技术的应用为分子生物学研究提供了一种简单、快速、经济的手段。该技术首先利用pcr扩增目的dna，然后将扩增产物变性并进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，区别扩增产物单链dna构象的多态性。为了高灵敏性特异显示sscp分析结果，已发展为多种pcr-sscp技术，例如扩增时利用引物标记或碱基掺入法而使扩增产物带有标记物（荧光物质、同位素、生物素等），也可以在电泳后用银染或溴化乙锭染色以显示结果。,（一） pcr-sscp银染法原理,在非变性条件下，dna单链在凝胶电泳中的迁移率除与dna链的长短有关外，更主要是取决于dna单链所形成的构象。单链dna由于分子内作用力而形成卷曲构型，在sscp分析中，单链dna因其碱基序列的变异（单个碱基置换或多个碱基插入或缺失等的改变）而导致构型改变，其迁移率必然发生改变，从而将变异的dna与非变异dna区分开来。 pcr-sscp银染技术是按常规pcr扩增特定靶基因序列，扩增产物变性为单链进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，再通过硝酸银（agno3）染色显示结果。,（二） pcr-sscp银染法方法,1运用pcr进行dna扩增,依据所用特异的dna模板和引物设置理想的扩增条件，按常规pcr方法进行。,2凝胶的制备,配胶（以5%凝胶为例）： 30%丙烯酰胺-0.8%双丙烯酰胺 17ml 5xtbe 20ml dh2o 62ml temed（n,n,n1,n1-四甲基乙二胺） 30l 混匀后加0.8ml 10%过硫酸铵。,3样品制备,将pcr产物（约3l）与样品缓冲液等体积混匀。样品缓冲液：95%甲酰胺，20mmol/l edta（ph8.0）、0.05%二甲苯青、0.05%溴酚蓝。 85-98变性5-10分钟，立即冰浴冷却。,4电泳,（1）每孔上样3-5l （2）恒压500v，4电泳12-15小时（使用测序电泳装置时）；或根据扩增片段大小及电泳槽和凝胶的大小，选择电泳条件。,5银染,（1）将带胶玻璃板置一方盆中，加入固定液（终止液）固定，并置水平振荡器在室温轻轻振荡至二甲苯青消失。回收固定液（终止液），用双蒸水漂洗凝胶3次，最后1次应弃尽双蒸水。 （2）现配制银染液500ml，并加入0.75ml甲醛（如凝胶较小可相应减少银染液及甲醛），倒入方盆，水平振荡器轻轻振荡，染色30分钟。倒弃银染液，双蒸水快速漂洗一遍，约5-10秒，立即竖起玻璃板漓干双蒸水。,6显影与定影,将预冷的500ml显影液内加入0.75ml甲醛、100l（10mg/ml）硫代硫酸钠，混匀后倒入方盆中一半，缓慢显影，当有带型出现时，倒弃显影液，再加入另一半显影液继续显影至所有带型显现为止。倒弃显影液，加入回收的固定/终止液，终止显影并固定影象5分钟。双蒸水漂洗凝胶2次，2分钟/次。,7拍照,在看片灯箱上拍照，或将胶板置室温干燥，可长期保存。,（三） pcr-sscp 注意事项,1凝胶,改变凝胶条件可以增加检测单个碱基改变的灵敏度，例如在4-12%范围调整丙烯酰胺浓度，以及相应交联剂双丙烯酰胺的浓度,2变性剂,凝胶中加入5-10%的甘油，或5%尿素或甲酰胺以及10%二甲亚砜或蔗糖等有助于提高敏感性。但在少数变异序列则检测条件不能加入甘油。,3温度,电泳的温度如不能很好控制，单链dna的迁移率会出现难以预料的变化。可以采取减少凝胶厚度、降低电压，有效的空气冷却或循环水冷却等措施，使温度恒定。,4核酸片段大小,用于sscp分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高。一般小于300bp，尤其是150bp左右的核酸片段更适于sscp分析。,5银染,必须使用不含杂质的超纯水或双蒸水，含杂质如卤素和金属离子的水，将使扩增信号减弱甚至不能显影。 硝酸银染色之后漂洗时间不宜过长，以510秒为宜，否则银离子会从dna上游离下来而减弱显影信号。 显影液必须在4温度下进行显影反应，以控制背景清晰度。 显影时间的控制必须长短适中，显色过浅或过深均影响结果的观察。,四、特殊pcr的介绍,pcr及其相关技术的发展十分迅速，已形成了一系列的适用于不同目的的特殊方法,（一） 原位pcr（in situ pcr）,是原位杂交的细胞定位技术与pcr的高灵敏度相结合的技术。该技术可以获得靶基因（靶dna或rna）在原始特异细胞的定位，而靶基因的细胞定位在多数情况都是重要的信息。 简要步骤：组织切片和细胞样品制备蛋白酶消化dna酶消化（用于原位pcr中的反转录）反转录步骤pcr反应检测。,（二） 固着pcr（sanchorde pcr, sapcr）,膜结合pcr是将模板dna固定，固着pcr是将引物固相化，再行pcr。此时pcr产物就被固相化，易于分离。例如可将引物固着于琼脂糖珠上。 这种固相化的引物可用于rtpcr、常规pcr，亦可进行cdna末端快速分析（racepcr）等。总之，凡是需要快速方便的分离pcr产物，均可使用这一技术。,（三） 不对称pcr（asymmetric pcr）,即在扩增循环中引入不同引物浓度，而得到单链dna。一般两条引物的浓度采用50100:1比例。在最初1015个循环中主要产物还是双链dna，但当低浓度引物被消耗尽后，高浓度引物介导的pcr反应就会产生大量单链dna。分离此扩增产物中的ssdna可用原引物或第三条内部引物直接测序。,（四） 多重pcr（multiplex pcr）,即在同一试管中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域。如果基因的某一区段缺失，则相应的电泳图谱上这一区带就会消失，多重pcr反应和southern blotting一样可靠，但要简便得多。多重pcr可以同时检测多个突变或病原。有利于诊断遗传疾病和感染疾病。,（五） 实时pcr（real time pcr）,实时pcr可以动态观察pcr反应产物增加的量及过程，与常规的pcr仅能检测终产物（end-points）的生成相比，具有准确定量的优点，是pcr技术的一大进步。目前常用于研究基因表达（rna表达）的定量分析。,dna物理图谱是指限制性内切酶的切点在dna链上的定位。它表示酶的特异识别序列在dna链上的出现频率和它们间的相对位置，故又称为限制性内切酶图谱。,第四节 dna物理图谱,一. 双酶解分析法,用一种限制性内切酶降解dna，可以在琼脂糖凝胶电泳上看到dna的酶解片段，根据片段的数目可以知道酶的切点数目，但是不能排列出这些片段在dna分子中的相对位置。采用酶两两组合进行彻底降解，比较双酶和单一酶解产物，可以确定酶切点的相对位置。,ajpi dna的分子量为9.0兆道尔顿（13.6kb），有一个xho和一个pst切口，两个ecor切口。它们的单酶和双酶解结果示于下表。,单解 xho pst,xho fx1=100.0,pst fp1=100.0,ajpi dna的三种酶单解和双解产物分析,fpx1=55.5 fpx2=44.5,fe1=51.8 fe2=48.2,fex1=51.8 fex2=41.6 fex3=6.6,fep1=38.0 fep2=13.8 fep3=48.2,ecor,片段长度以占总长度的百分比（相对长度）表示。fpx1中的p代表pst，x代表xho，1代表一个片段， fpx1代表pst和xho双酶解产生的第一个片段的相对长度。其余符号类推。,酶,相对 长度,酶,在描绘xho、 pst和 ecor三酶切口相对位置时，设xho位点在环状dna的零点位，将圆周平分为100分， pst位点按xho和 pst的双解结果，可定位于顺时针方向44.5处。那么ecor的两切口如何定位，下图中提供了两种可能性。若ecor两切点按假设1定位，那么ecor和 pst的双解产物应得相对大小分别为48.9,48.2和2.9三个酶解片段；但实验结果得到的是48.2，38.0和13.8三个相对大小片段。因此ecor的两个切口应按假设2来定位。这样xho、 pst和 ecor三个酶在ajpi dna上定位就借双酶降解作用完成了。,二. 标记片段部分降解分析法,三. 片段杂交法,本法主要是用分子杂交技术，将一种酶产生的片段标记同位素，逐一与其它种酶解产物在硝酸纤维膜上进行杂交，来测定各酶切口的位置。,酶各标记片段与酶和各片段杂交结果,a b c d,酶,a b c ,酶,+,+,+,+,a b c,酶,+,+,+,、为三种不同特异性的酶，它们的彻底降解片段由大到小分别标以a、b、c、d。,c b d a,b c a,a b c,酶、 各片段在线性dna中的定位顺序。,（按上表的杂交实验结果而来）,酶 ,+,四. 全序列分析法,一般是先用其它方法制作一个简单的酶谱，然后测定dna的核苷酸全序列，再根据全序列用计算机推出更详细的酶谱。这种方法是将dna的全部序列和酶的识别序列均输入计算机，让计算机识别各切点的位置，显然酶谱更精确和更详细。,第五节 dna 序列测定,一、dna序列测定的策略,dna序列测定简便快速，但由于受到电泳凝胶分辨率的限制，一般每次测序只能测出500600个核苷酸，因此对更长的dna分子的测定必须考虑测序的策略问题，以确保dna序列分析简便、快速、准确。,（一）鸟枪法（或随机法）,采用超声波处理或酶解的方法，将待测的dna片段随机的切成大小不同的小片段并制成亚克隆。分别测定核苷酸序列后，通过计算机处理各片段核苷酸序列的资料，最终将重叠的序列连成待测dna的全长序列。,（二）套式缺失法,采用核酸外切酶从待测dna片段的一端逐个降解核苷酸，通过选择不同的降解时间，可以获得一套长短不同的单向缺失的突变体。突变体亚克隆后分别进行序列测定，然后将这一整套单向缺失突变体的核苷酸序列拼接起来,（三）引物延伸法,利用通用引物确定待测dna片段两端的序列以后，根据测出片段的一端序列，设计新的引物再向前测序。以次方式不断向前测序，直到获得待测片段的全长序列。,二、sanger双脱氧链终止法,2 3双脱氧核苷酸末端终止法是sanger于1977年建立的用于测定dna序列的快速、简便、准确的方法。它具有放射性核素用量小、接触时间短、节省样品、操作简便等优点。尤其是用m13载体系统和puc载体系统以后，更加扩大了它的应用范围，极大地推动了dna一级结构的研究。,sanger双脱氧链终止法原理,在dna复制反应中加入 23 双脱氧核苷酸（ddntp），由于 ddntp在反应中不能形成3，5 磷酸二酯键，具有阻断dna复制的作用。因此测定时，若以待测dna片段为模板，在dna聚合酶（klenow或t7dna聚合酶）、引物、dntp（其中一种为 32p dntp或 35s dntp）存在下，并分别加入ddatp、ddgtp、ddttp进行复制反应。反应结束后，即可得到一系列分别以ddatp、ddgtp、ddctp或ddttp为结尾但长度不同的dna片段。四组反应产物若在同一块凝胶板内，相邻的泳道中进行电泳分离，根据放射自显影图谱，从不同的分组和电泳条带的顺序，可以直接读出待测dna片段的核苷酸序列。,三、maxam gilbetrt化学裂解法,用硫酸二甲酯、肼等化学试剂处理具有末端放射性标记的dna片段，使待测序的dna片段按加入的化学试剂种类和条件的不同，分别发生特异性核苷酸裂解。由此产生一系列长短不同的dna链裂解物，经凝胶电泳按片段大小分离和放射自显影之后，即可根据特异裂解的核苷酸的种类和性质以及x线片上感光的条带顺序，直接读出其核苷酸序列。 化学裂解法测定的序列直接来自于原dna片段，而不是酶促合成反应所产生的拷贝，避免了复