恶性黑素瘤细胞株细胞间粘附分子1的改变及临床意义

1 / 9 恶性黑素瘤细胞株细胞间粘附分子 1的改变及临床意义 【摘要】 目的 探讨细胞间粘附分子 1(ICAM 1)在恶性黑素瘤细胞株的表达及临床意义。方法用体外细胞培养方法、逆转录聚合酶链反应技术，观察恶性黑素瘤细胞株 MM8 1在温热及某些细胞因子刺激下，细胞形态、细胞增殖能力及ICAM-1 的基因水平变化。结果温热、 干扰素、肿瘤坏死因子 可使细胞形态改变、细胞增殖能力下降、 ICAM 1 的表达增加，白介素 2 未能影响细胞形态及增殖能力，也未能使 ICAM 1 明显改变。结论 恶性黑素瘤细胞株 ICAM 1的表达与细胞被破 坏有关，同时为温热、 干扰素、肿瘤坏死因子 - 作为治疗恶性黑素瘤的辅助手段提供了理论依据。 【关键词】黑素瘤细胞因子细胞间粘附分子 1 逆转录聚合酶链反应 The Expression of Intercellular Adhesion Molecule1 in Human Malignant Melanoma Cell Lines and Its Clinical Significance XIA Jianxin， J Nakayama， K Urabe， et al. Department of Dermatology， Second Hospital, Norman Bethune Medical University， Changchun 130041 2 / 9 【 Abstract】 Objective To investigate the expression of ICAM 1 in human malignant melanoma （ MM） cell lines and its clinical significance Methods Human MM cell lines MM8.1 were cultured and analyzed by reverse transcription polymerase chain reaction（ RT PCR） , the cell shape， cell growth ability and ICAM 1 by mRNA expression under the stimulation of hyperthermia or cytokines were observed Results Hyperthermia、 IFN and TNF could change cell shape， reduce cell growth ability and increase the expression of ICAM1 IL 2 could not influence the cell shape and the expression of ICAM 1 Conclusion The expression of ICAM 1 in MM cell lines may be correlated with the cell destruction， which provides theoretical basis of supplementary therapy for MM with hyperthermia、 IFN and TNF 【 Key words 】 Melanoma Cytokine Intercellular adhesion molecule 1 Reverse transcription polymerase chain reaction 人恶性黑素瘤 (MM)细胞细胞间粘附分子 1(ICAM-1)的发现在国外有多家报道 1，认为 MM 患者血清中可溶性 ICAM 1 的浓度与肿瘤进展程度呈正相关。作为 MM 的辅助治疗手3 / 9 段有温热疗法及细胞因子等。以前曾观察到培养人 MM 细胞株在体外进行温热及干扰素 ( IFN)、肿瘤坏死因子(TNF- )处理后，细胞表面 ICAM 1 的表达及培养液中 ICAM 1 的释放增加 2。为探求在温热及细胞因子刺激下 MM 细胞株 ICAM 1 的表达发生改变的机理，我们将人 MM 细胞株在温热及某些细胞因子刺激下，观察细胞形态和增殖能力及ICAM 1 的基因水平变化，现报道如下。 材料与方法 一、材料 1 MM8 1 是从恶性黑素瘤患者淋巴结转移灶分离培养而确立起来的，保存于日本九州大学医学部皮肤科教室，细胞培养采用文献 3的方法进行。 2 IFN、 TNF和白介素 2(IL 2)均由大日本制药株式会社提供， ICAM 1 引物由日本九州 大 学 医 学 部 皮 肤 科 教 室 提 供 ， ICAM-15 为AATGCCCAGACATCTGTG， ICAM 13为 GCGTAGGGTAAGGTTCTT，提取 RNA 及逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)试剂 均为日本宝酒造株式会社生物事业部门提供，此对引物扩增片段为 327bp。 二、方法 1 MM细胞配成浓度为 1 104个 /mL，4 / 9 取 2mL 放入培养皿中培养 24h(贴壁 )，更换培养液后分别置入 37 C、 41 C、 43 C 含 5 CO2 的培养箱中培养， 3h 和6h 后观察细胞形态，停止温热处理，重新放入 37 C 培养箱中培养，经过约 3d 恢复后，观察细胞形态，计数， 41 C6h、43 C6h 及对照组做 RNA 的提取及 RT PCR。 表 1 温热及某些细胞因子刺激下恶性黑素瘤细胞增殖能力的改变 不同处理 细胞株数 细胞数 (1 105) 与对照组比较 t值 P 值 组间比较 t 值 P 值 对照组 3 5.46 0.29 41 6h 3 3.01 0.12 13.52 0.05 43 6h 3 1.54 0.26 17.43 0.05 -IFN100U/mL 3 2.78 0.05 15.77 0.05 TNF- 100U/mL 3 3.62 0.36 6.89 0.05 0.05 1.45 IL-2100U/mL 3 5.74 0.45 0.90 0.05 -IFN TNF 10U/mL 3 2.97 0.55 6.931 0.05 -IFN TNF 100U/mL 3 3.01 0.14 3.17 2因子刺激实验：将上述细胞同时做细胞因子刺激实验，浓度为 1 104 个 /mL，贴壁培养 24h，更换培养液后分别加入10U/mL、 100U mL 的 IFN、 TNF、 IL 2 及 -IFNTNF-， 37 C 培养 72h 后观察细胞形态，计数，收集IFN、 TNF、 IL 2 组细胞 (浓度均为 100U/mL)，做 RNA5 / 9 的提取及 RT PCR。 3 RNA 的提取：将细胞剥离 (用胰蛋白酶 -EDTA)，放入 15cm 的离心管中 2000r/min5min 离心，弃上清液；放入表面活性剂 Catrimox-14TM1mL 溶解细胞，并将此溶液移回原试管中； 1000r/min5min，弃上清液；加入锂试剂 1mL，振动， 15000r/min5min，弃上清液；加入冷的 70乙醇 1mL 洗沉淀物，吸净乙醇，干燥 10min；放入 50 LDEPC水溶液，溶解沉淀物， 70 C 保存。 4 ICAM 1的 RT-PCR：逆转录反应前先将标本 90 C5min处理后再置于冰上急剧冷却。逆转录反应试剂为： 3 -引物1 L(终浓度 2.5 mol/L)， 10 RNAPCR 缓冲液 2 L， MgCl24 L(终浓度 5mmol/L)， dNTPs8 L(终浓度 1mmol/L)，核苷酸酶抑制剂 0.5 L(1U/ L)，逆转录酶 1 L(0 25UL)，样本 2 L， RNA 酶自由水 1.5 L。逆转录反应条件： 42C30min， 99 C5min， 5 C5min，此时已合成 cDNA。 PCR 反应试剂为： MgCl26 L(终浓度 2 5mmol/L)， 5 -引物 1L(终浓度 0-2 mol/L)， RNAPCR 缓冲液 8 L， Taq 酶 0.5 L，加 DEPC 水补至 100 L， Taq 酶于 98 C 预变性 5min 后加入。反应条件： 94 C30s， 55 C30s， 72 C1.5min，共 35 个循环，末次置 72 C7min，反应结束后，取 10 L 反应产物在含溴化乙锭 (EB)的 1 5琼脂糖凝胶中电泳 30min，紫外6 / 9 灯下观察结果。为了避免各标本中总 RNA 的差异，用 -肌动蛋白测各标本中总 RNA 量。 5 ICAM-1cDNA 量的测定 4及结果分析：电泳后，用 CCD(charge-coupleddevice)影像系统测定每条带的 EB荧光密度，将 ICAM-1CDNA 的 EB 荧光密度除以 -肌动蛋白的EB 荧光密度得出 ICAM-1mRNA 专用单位。因 -肌动蛋白 mRNA在同一种细胞的含量是一致的，其量与总 RNA 的量成正比，其意义在于消除加样不均所致的每一样本 mRNA量的不一致。 表 2 各样本的 ICAM 1mRNA 荧光密度及其相对值 mRNA 对照 TNF- -IFN IL-2 41 6h 43 6h ICAM-1 24282 53903 52484 XX3 22628 33874 -肌动蛋白 27590 19903 21580 35318 35402 25106 ICAM-1/ -肌动蛋白 0.88 2.71 2.43 0.57 0.64 1.35 结果 1 -IFN、 TNF-均可改变细胞形态，表现为细胞形态不规则，胞膜不清，大小不等，温度越高，热处理时间越长，细胞形态变化越明显。细胞因子中尤以 TNF -IFN 合用细胞形态改变最明显。 2 1，数据处理采用 t检验。 3.ICAM 1cDNA 量的测定：如表 2，从中可 以看出 TNF (100U/mL)使 ICAM 1 增加 3.08 倍 (2.71/0.88)，7 / 9 IFN(100U/mL)使 ICAM 1 增加 2.76 倍 (2.43/0.88)， 43 6h使 ICAM 1 增加 1.54 倍 (1.35/0.88)， IL 2 及 41 6h 未能使 ICAM 1 增加。 讨论 目前对于肿瘤的治疗除了手术、放疗、化疗以外，还有细胞因子及温热疗法等，某些细胞因子常被应用于肿瘤的辅助治疗如干扰素及肿瘤坏死因子等，本实验中，用IFN、 TNF及 IL 2 在体外作用于 MM 细胞，结果观察到： IFN、 TNF可破坏细胞，使细胞增殖能力下降，体外实验证实了 IFN、 TNF的抗肿瘤作用， IL 2 未能改变细胞形态，也未能影响细胞的增殖能力。日本九州大学医学部皮肤科采用局部温热灌流疗法治疗进行期的四肢 MM，通过超声波观察可见肿瘤体积缩小，取得了较好的临床效果5，本实验中，采用 41及 43处理 3h 和 6h，从中观察到，温热处理后，随着温度的增高，热处理时间的延长，细胞形态变化越明显，细胞增殖能力下降越明显，与对照组比较及组间比较 P 作者单位：夏建新 130041 长春，白求恩医科大学第二临床学院皮肤科；中 山树一郎，占部和敬 日本九州大学医学部皮肤科教室；母义明 北京解放军第三零一医院内分泌科 参考文献 1 江口弘晃，堀越贵志，高桥诚，他 .恶性黑色肿8 / 9 ICAM 1 发现 .日皮会， 1992， 102： 807 814 2 管晓春，中山树一郎，中岛学，他 .恶性黑色肿细胞 ICAM 1发现可溶性 ICAM 1 放出变动关研究 .日皮会，1997， 107： 747 753. 3 Nakayama J， Moroi Y， Toshitani A,et al Responses of B16 melanoma cell lines,F1 and F10, to hyperthermia lymphokine activated killer cells and a combination of both in vitro Br J Dermatol， 1992， 126： 131 136 4 Yokoi H， Natsuyama S， Iwai M， et al Non radioisotopic quantitative RT PCR to detect changes in mRNA levels during early mouse embryo development Biochem Biophys Res Commun， 1993， 195： 769 775 5 Nakayama J ， Takeuchi M ， Nagae S ， et al Hyperthermic isolated limb perfusion with intraarterial administration of carboplatin and or interferon for the treatment of malign