研究青天葵活性部位的体外抗肿瘤作用

1 / 10 研究青天葵活性部位的体外抗肿瘤作用 摘要：目的确定广西特产药材青天葵体外抗肿瘤作用的活性部位。方法青天葵部位提取物的制备主要采用溶剂法 , 青天葵全草先用 95%的乙醇提取，得到的提取物进一步用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、甲醇依次提取，得到极性由小到大的 4个提取部位。活性筛选采用 MTT法实验，观察青天葵提取物对 7种肿瘤细胞的生长抑制作用。结果青天葵石油醚和醋酸乙酯部位具有一定的体外抗肿瘤作用。结论首次确定了青天葵的石油醚和醋酸乙酯部分是体外抗肿瘤作用的有效部位。 关键词： 青天葵 体外抗肿瘤作用 活 性部位 青天葵为兰科 Orchidaceae 植物毛唇芋兰 Nervilia foadii(Hance) Schltr.的干燥全草，入药始载于岭南采药录，主要产于我国的广西、广东、海南，四川、云南，泰国也有分布，是广西特产药材 1 3，具有清肺止咳、健脾消积、镇痛止痛、散淤消肿、清热解毒之功效，主治肺痨、咳嗽咳血、中毒、跌打损伤、小儿疳积、精神病、口腔炎、急性咽喉炎等症。近来还用含有青天葵的复方制剂治疗鼻咽癌以缓解症状 4，但未发现国内外对其抗肿瘤有效成分及药理作用的研究。为此，笔者对青天 葵的干燥全草进行2 / 10 了药效学实验研究，对青天葵的石油醚、氯仿、醋酸乙酯、甲醇 4个不同部位采用体外抗肿瘤实验进行初筛，为阐明青天葵的抗肿瘤作用并筛选出有效部位打下基础。现报道如下。 1 材料与仪器 1.1 受试样品 药材青天葵来源于南宁药材站，经广西中医学院刘寿养副教授鉴定为兰科 Orchidaceae 植物毛唇芋兰 Nervilia foadii(Hance) Schltr.的干燥全草。对青天葵的干燥全草进行提取分离得 4 个部位：石油醚提取物（ A）、醋酸乙酯提取物（ B）、正丁醇提取物（ C）、乙醇提取 物（ D）。 A， B， C和 D均用含有 DMSO的培养液溶解，均配成浓度为 480 g/ml的溶液，置于 -20 冰箱密闭避光保存。临用前用不含血清和抗生素的 RPMI1640（ NG108-15 用 DMEM）液稀释至所需浓度， DMSO终浓度在 0.01%水平。 1.2 培养液 1.2.1 RPMI 完全培养液含 RPMI1640培养基（ GIBCO）、3%谷氨酰胺、卡那霉素 750 g/ml 、 10% FBS（临用前加）。 1.2.2 DMEM 完全培养液含 DMEM 培养基（ GIBCO）、卡那霉素 750g/ml 、 10%FBS（临用前加）。 1.3 细胞株 白血病细胞株 L1210 和 P388D1、宫颈癌细胞株 Hela、人胃癌细胞株 SGC7901、黑色素瘤细胞株 B16、3 / 10 神经肿瘤细胞株 NG108-15 等均购自上海细胞生物研究所细胞库，人肝癌细胞株 Hela7404 由广西医科大学药理教研室提供。 1.4 试剂 MTT（四甲基噻唑蓝）为德国 Sigma 公司产品，批号020609； FBS（胚胎牛血清）为美国 Hyclone 公司产品，批号 0405； RPMI1640 和 DMEM 培养基为 GIBCO公司产品，批号1120708 和 0311； Trypsin（胰蛋白酶）由天津市灏洋生物制品有限责任公司提供，批号 XX03； DMSO（二甲基亚砜）由天津汇英化学试剂有限公司提供，批号 XX0526。 1.5 细胞培养肿瘤细胞用含 10%灭活新生小牛血清的RPMI1640（ NG108-15肿瘤细胞用 DMEM）培养基在 37 ， 15%CO2条件下培养，取对数生长期细胞用于实验。 1. 6 仪器 Thermo Forma 型 CO2 培养箱，美国产； Olympus型倒置显微镜，日本产； Biocell 型酶标仪，奥地利产； AG135型电子天平 ，瑞士产；培养瓶，美国产； 3072 型 96 孔板，丹麦产； 3001 型培养皿，美国产； DLF560 型超净工作台，荷兰产； HV-50自动高压灭菌器，日本产。 2 方法 2.1 样品的提取分离 4 / 10 将青天葵药材阴干，去除杂质，粉碎为粗粉，称取 9.0 kg 药材粗粉，用 95%乙醇（食用）浸泡 48 h 后渗滤提取，用 10 倍量乙醇提取。合并乙醇提取液，减压回收乙醇，得粗提物，干燥后得 921.3 g（得膏率 10.2%）。将所得的粗提物用硅胶拌匀后，依次用石油醚（ 60 90 ）、醋酸乙酯、正丁醇、甲醇回流提取，回收 溶剂，得石油醚部位 180 g，醋酸乙酯部位 87.5 g，正丁醇部位 86 g，甲醇部位 50 g。 2.2 MTT法 取对数生长期细胞以 0.25%胰蛋白酶和 0.02%EDTA 消化后，用培养液稀释。在 96 孔培养板中每孔加入 200 l（含有 5 000 个 /ml 肿瘤细胞）含 10%FBS 的 RPMI1640 培养液， NG108-15 细胞则用含 10%FBS 的 DMEM 培养液，细胞置37 ， 10%CO2培养 24 h 后，实验组分别加入最终浓度为 15，30， 60， 120， 240 g/ml 提取物的培养液，对照组则加入等 体积溶剂的培养液，每组 4孔，重复 4次。置 37 ， 10%CO2培养 5 d 后，弃去上清液，加入 200 l/ 孔新鲜配置的含0.2 mg/ml MTT 的无血清培养液， 37 继续培养 4 h，弃上清液，加入 200 l DMSO ，振荡混匀后，在酶标仪上以波长为 550 nm，参比波长为 450 nm测定 OD值。 2.3 药物对肿瘤细胞生长的抑制率的计算方法 5 肿瘤细胞生长抑制率（ %） =（ 1-实验组平均 OD值）/对照组平均 OD值 100% 5 / 10 2.4 半数抑制浓度 C50 的计算 2.4.1 直线回归 法 6 当细胞生长抑制率与药物浓度有对数关系时，以各个不同药物的对数浓度为横坐标，相应的细胞生长抑制率为纵坐标，求出直线回归方程，根据该方程计算出 IC50。 2.4.2 改良寇氏法 7 当细胞生长抑制率与药物浓度不存在对数关系时，采用寇氏法计算 IC50。药物 IC50 值的公式为： IC50=lg-1 Xm-i (p -0.5)。式中 Xm：设计的最大浓度的对数值； i：相邻两组浓度对数值之差； p ：各组生长抑制率之和； 0.5：经验常数。 3 结果 3.1 不同浓度提取物对白血病细 胞株 L1210的抑制结果见表 1。石油醚部位和醋酸乙酯部位对白血病细胞株 L1210都有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比。细胞生长抑制率与药液浓度无对数关系，故采用寇氏法计算 IC50，IC50分别为 83.5 g/ml 和 76.2 g/ml 。正丁醇部位和甲醇部位对白血病细胞株 L1210基本无活性。表 1 受试样品对白血病细胞株 L1210 抑制的影响 (略 ) 3.2 不同浓度提取物对白血病细胞株 P388D1 的抑制结果见表 2。石油醚部位和醋酸乙酯部位对白血病细胞株6 / 10 P388D1 都有直接抑制作用，抑制率与提取物浓 度成正比。细胞生长抑制率与药液浓度无对数关系，故采用寇氏法计算IC50。 IC50分别为 60.8 g/ml 和 90.1 g/ml 。正丁醇部位和甲醇部位对白血病细胞株 L1210 无活性。表 2 受试样品对白血病细胞株 P388D1 抑制的影响（略） 3.3 不同浓度提取物对宫颈癌细胞株 Hela 的抑制结果见表 3。石油醚部位和醋酸乙酯部位对宫颈癌细胞株 Hela都有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比。细胞生长抑制率与药液浓度存在对数关系，故以曲线回归法求 IC50。IC50 分别为 39.5g/ml 和 74.6 g/ml 。正丁醇部位和甲醇部位对宫颈癌细胞株 Hela 无活性。表 3 受试样品对宫颈癌细胞株 Hela抑制的影响（略） 3.4 不同浓度提取物对人胃癌细胞株 SGC7901的抑制结果见表 4。石油醚部位对人胃癌细胞株 SGC7901 有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比。细胞生长抑制率与药液浓度存在对数关系，故以曲线回归法求 IC50， IC50 为 78.7 g/ml 。醋酸乙酯部位、正丁醇部位和甲醇部位对人胃癌细胞株 SGC7901 无活性。表 4 受试样品对人胃癌细胞株SGC7901的抑制的影响（略） 3.5 不同浓度提取物对黑色素瘤细胞株 B16的抑制结果如表 5 显示，醋酸乙酯部位对黑色素瘤细胞株 B16 有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比。细胞生长抑制率与7 / 10 药液浓度不成对数关系，故以寇式法求 IC50， IC50 为 62.0 g/ml 。石油醚部位、正丁醇部位和甲醇部位对黑色素瘤细胞株 B16 无活性。 3.6 不同浓度提取物对神经肿瘤细胞株 NG108-15 的抑制结果如表 6显示，石油醚部位和醋酸乙酯部位对神经肿瘤细胞株 NG108-15 都有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比。细胞生长抑制率与药液浓度成对数 关系，故以曲线回归法求 IC50，它们的的 IC50分别为 49.4 g/ml 和 54.9 g/ml 。正丁醇部位和甲醇部位对神经肿瘤细胞株 NG108-15基本无活性。表 5 受试样品对黑色素瘤细胞株 B16抑制的影响（略） 3.7 不同浓度提取物对人肝癌细胞株 Hela7404 的抑制结果见表 7。石油醚部位和醋酸乙酯部位对人肝癌细胞株Hela7404都有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比。细胞生长抑制率与药液浓度均成对数关系，故以曲线回归法求 IC50， IC50分别为 78.9 g/ml 和 41.5 g/ml 。 正丁醇部位和甲醇部位对人肝癌细胞株 Hela7404基本无活性。表 6 受试样品对神经肿瘤细胞株 NG108-15抑制的影响（略）表 7 受试样品对人肝癌细胞株 Hela7404 抑制的影响（略） 4 讨论 体外实验抗肿瘤药物的筛选方法中，实验选择了四氮8 / 10 唑蓝法 MTT 法。 1983 年由 Mosmann 在免疫学研究中应用于鼠淋巴细胞系研究 IL-2 等细胞应用于对细胞存活和增效的影响，而建立 MTT 方法 8，随后， Denizot 和 carmichael等进一步改进并获得更好的效果，使之运用于人类肿瘤细胞体外药敏试验 9,10。 表 1 7显示，青天葵石油醚部位在受试 5个剂量（ 15，30， 60， 120， 240 g/ml ）下对白血病细胞株 L1210和 P388D1、宫颈癌细胞株 Hela、人胃癌细胞株 SGC7901、神经肿瘤细胞株 NG108-15、人肝癌细胞株 Hela7404 等 6 种瘤株都有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比， IC50 分别 83.5，60.8， 39.5， 78.7， 49.4， 78.9 g/ml 。青天葵醋酸乙酯部位在受试 5 个剂量（ 15， 30， 60， 120， 240 g/ml ）下对白血病细胞株 L1210 和 P388D1、宫颈癌细胞株 Hela、黑色素瘤细胞株 B16、神经肿瘤细胞株 NG108-15、人肝癌细胞株 Hela7404 等 6 种瘤株都有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比， IC50 分别 76.2， 90.1， 74.6， 62.0， 54.9，41.5 g/ml 。正丁醇部位和甲醇部位对 7 种肿瘤细胞都无明显直接抑制作用。 随着分子肿瘤学研究的不断深入，体外抗肿瘤实验已成为抗肿瘤药物研发过程中必不可少的一种方法。该方法具有经济、快速、高效的优点。目前最常用的体外抗肿瘤筛选方法为 MTT法。实验中对青天葵石油醚、醋酸乙 酯、正丁醇9 / 10 和甲醇部位，采用 MTT法，选用 7 种肿瘤细胞株进行抑瘤实验，以期得到具有较高可信度的体外抗肿瘤活性的有效部位，同时为青天葵的进一步研究提供依据。 青天葵的体外实验结果表明，经过系统提取分离后，青天葵石油醚和醋酸乙酯部位具有明显的抑瘤作用。本实验为青天葵抗肿瘤有效成分的筛选及抗肿瘤作用机理研究，提供了一定的理论依据。但在体外实验中对癌细胞有抑制作用和杀伤作用的药物，在活体中由于各种综合因素的作用而不一定具有抗肿瘤作用。因此，还必须对青天葵石油醚和醋酸乙酯部位进行体内实验以验证其有抗肿瘤作用。 【参考文献】 1江苏新医学院 .中药大辞典 M .上海 :上海科学技术出版社 ,1975:1231. 2南京中医药大学 .现代中药大辞典 M .北京 :人民卫生出版社 ,2001:1167. 3广西壮族自治区卫生厅 .广西中药志 M .南宁 :广西壮族自治区人民出版社 ,1959:328. 4周洁 ,李竹庭 .中药与肿瘤免疫 J .天津中医药 ,XX,21(3):228. 5徐叔云 ,卞 如 ,陈 修 .药理实验方法学 ,第 2 版 M .北京 :人民卫生出版社 ,1991:1441. 10 / 10 6王天山 ,陆跃鸣 ,马国祥 ,等 .鼓槌石斛中化学成分对 K562 肿瘤细胞株生长抑制作用体外实验 J .天然产物研究与开发 ,1997,9（ 2） :1. 7刘衡 ,符仁义 ,李丰益