ELISA实验设计.doc

PRRSV N蛋白抗体检测间接ELISA方法的建立1 材料：1.1 蛋白、血清、酶标二抗原核表达PRRSV N蛋白；标准阳性血清和阴性血清，待检血清；自制HRP标记兔抗猪IgG；1.2 主要试剂和溶液包被液（50 mmol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液）Na2CO31.59 gNaHCO32.93 g准确称取后，溶于950 mL的蒸馏水中，调pH值为9.6，定容到1 L；PBS-T洗涤液 1000 mL 10 mmol/L pH7.4的PBS中加入0.5 mL Tween-20；封闭液和血清稀释液 含10%小牛血清的PBS-T缓冲液，10%马血清的PBS-T缓冲液，含5%BSA的PBS-T缓冲液，含10%BSA的PBS-T缓冲液，含5%脱脂奶的PBS-T缓冲液；底物溶液 100 mmol/L的柠檬酸溶液（21 g柠檬酸C6H6O7H2O溶于去离子水，定容至1 L）24.3 mL，200 mmol/L Na2HPO412H2O（71.6 g Na2HPO412H2O溶于去离子水，定容至1 L）25.7 mL混匀，加入50 mg的四甲基联苯胺（TMB），临用前加入50 L的30% H2O2；终止液（2 mol/L H2SO4） 每200 mL终止液，由蒸馏水177.8 mL和浓硫酸22.2 mL混和而成。1.3 主要仪器设备电热恒温培养箱；4冰箱；酶标仪。2 步骤：2.1抗原包被浓度和二抗稀释度的确定将原核表达的N蛋白分别作2.0 g/mL，1.0 g/mL，0.5 g/mL，0.25 g/mL，0.1g/mL，0.05 g/mL连续稀释6个稀释度，每个稀释度重复两孔，100 L/孔，4包被酶标反应板过夜。将自制HRP标记的兔抗猪二抗分别做1:50、1:100、1:200和1:400一系列倍比稀释，每个稀释度重复两孔，100 L/孔，组成方阵确定重组蛋白的最佳包被浓度和二抗稀释度。封闭1 h后，每个稀释度重复两孔，100 L/孔，各步37反应30 min，显色5min后终止。在酶标仪测定各孔OD450nm值。先取阳性OD450nm值在1左右的，然后再从中找出阳性血清OD450nm值和阴性血清OD450nm值之比（即P/N）最高的反应孔的抗原浓度和二抗稀释度为最佳抗原包被浓度和二抗稀释度。表1 N蛋白最佳抗原包被浓度和酶标二抗稀释度确立抗原包被浓度OD450nm二抗稀释度2.0g/mL1.0g/mL0.5g/mL0.25g/mL0.1g/mL0.05g/mL1:50 P*NP/N1:100PNP/N1:200PNP/N1:400PNP/N2.2 缺失肽包被条件的确定 以最佳抗原浓度包被酶标板。以37包被2 h加4过夜；4过夜和37包被2 h四种条件包被酶标板，其余条件不变进行间接ELISA。以P/N值最大且阳性OD450nm值接近于1.0的孔对应的包被条件为最佳的抗原包被条件。表2 N蛋白最佳包被条件确立包被条件OD450nm37 2 h372 h + 4过夜4 过夜阳性OD450nm阴性OD450nmP/N2.3 血清稀释度的确定以最适抗原浓度和最佳包被条件包被酶标板，并以HRP标记山羊抗猪二抗最佳稀释度进行间接ELISA，将已知的阳性血清和阴性血清作1:25、1:50、1:100、1:200和1:400连续几个稀释度稀释，其余条件不变进行间接ELISA。表3 N蛋白最佳血清稀释度的确立OD450nm血清稀释度1:251:501:1001:2001:400阳性OD450nm阴性OD450nmP/N2.4 封闭液及血清稀释液的确定以最适的抗原浓度和最佳包被条件包被酶标板，洗涤后，加入不同的封闭液。第一组用10小牛血清进行封闭；第二组：用10马血清进行封闭；第三组：用5BSA进行封闭；第四组：用10BSA进行封闭；第五组：用5脱脂奶进行封闭。37封闭2 h，其余条件不变进行间接ELISA，以P/N值最高者为最佳封闭液及血清稀释液。表4 N蛋白封闭液和血清稀释液的确定封闭液或血清稀释液OD450nm阳性血清OD450nm阴性血清OD450nmP/N10%小牛血清10%马血清5%BSA10%BSA5%脱脂奶2.5 封闭时间的确定以最适的抗原浓度和最佳包被条件包被酶标板，洗涤后，加入确定的最佳封闭液5%脱脂奶，以37不同封闭时间，其余条件不变进行ELISA，确定合适的封闭时间。以P/N值最高者为最佳封闭时间。表5 N蛋白最佳封闭时间的确立OD450nm封闭时间37 30 min37 60 min37 90 min37 120 min阳性OD450nm阴性OD450nmP/N2.6 血清反应时间的确定在已经优化的反应条件基础上，加入标准阴阳性血清进行反应，按作用的时间分为4组，第一组：37作用30 min；第二组：37作用60 min；第三组：37作用90 min；第四组37作用120 min。再经过酶标抗体37作用30 min后加入底物溶液显色，终止反应，测定各孔的OD450nm值，计算出各组阴阳性血清的P/N值，以确定待检血清反应的最佳时间。表格同表格5。2.7 酶标二抗反应时间的确定在已经优化的反应条件的基础上，加入标准血清进行反应，然后加入酶标二抗，按酶标二抗的作用时间分为4组，37作用30 min；第二组：37作用 60 min；第三组：37作用90 min；第四组37作用120 min。经洗涤，加入底物显色，终止反应，测定各孔的OD450nm值，计算出各组阴阳性血清的P/N值，以确定待酶标二抗反应的最佳时间。表格同表格5。2.8 底物反应时间的确定在已经优化的反应的条件基础上，加入标准血清进行反应，然后加入酶标二抗，作用后加入底物显色，按底物的作用时间分成5组，37作用10 min；第二组：37作用15 min；第三组：37作用20 min；第四组37作用25 min；第五组37作用30 min。经洗涤，加入底物显色，终止反应，测定各孔的OD450nm值，计算出各组阴阳性血清的P/N值，以确定底物反应的最佳时间。表6 N蛋白底物反应时间的确立反应时间OD450nm10 min15 min20 min25 min25 min30 min阳性OD450nm阴性OD450nmP/N2.9 阴阳性临界值的确定用N蛋白包被酶标板，按照已建立的间接ELISA方法，检测20份经IDEXX N蛋白抗体检测试剂盒检测为PRRSV N蛋白抗体阴性和经RT-PCR检测为PRRSV病毒核酸阴性的血清样本，每份血清重复2孔，进行ELISA测定，结果见表9。表7 N蛋白阴阳性临界值的确定OD450nm血清编号 重复1重复2均值1234567891011121314151617181920经计算20份血清样本的OD450nm值平均值和标准差。根据统计学原则，当样本的OD450nm值大于阴性样本OD450nm值平均值3标准差（SD）时，可以在99.9%水平上判定为阳性。2.10 交叉反应试验按照已经确立的间接ELISA操作程序，分别用引起猪繁殖障的五种主要疫病猪瘟、猪伪狂犬病、猪圆环病毒病、猪细小病毒病、猪乙型脑炎的阳性血清进行间接ELISA的检测，检测这5种疫病的阳性血清与纯化的原核表达N蛋白有无交叉反应。用PRRSV BJ-4、HB-1/3.9和JXwn06人工感染猪的阳性血清进行PRRSV Nsp2抗体的间接ELISA检测，并计算原核表达N蛋白与不同PRRSV毒株感染血清的交叉反应率。2.11. 重复性试验取4块不同批次包被