实验一、蛋白质的等电点测定和沉淀反应.ppt

实验一、蛋白质等电点测定及沉淀反应,一、实验目的,1、了解蛋白质的两性解离性质 2、学习测定蛋白质等电点的一种方法 3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识 4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义 5、了解蛋白质变性与沉淀的关系,二、实验原理,蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡： 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。,当溶液的pH为一定值时，蛋白质极性基团解离的正负离子数相等，净电荷为0，此溶液的pH值为该蛋白质的等电点。 不同蛋白质具有各自特定的等电点，与该蛋白质的组成结构有关。 在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用性质的变化测定各种蛋白质的等电点。 常用方法：测其溶解度最低时的溶液pH值。,问题：蛋白质等电点的测定还有哪些方法?,本实验通过观察不同pH溶液中酪蛋白的溶解度来测定其等电点。 用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同pH值的缓冲液。向各缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。,在水溶液中，蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体。 在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。 蛋白质的沉淀反应可分为两类。,可逆的沉淀反应 蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。 如：盐析作用、低温下用乙醇（丙酮）短时间作用于蛋白质。 提纯蛋白质时，常利用此类反应。,问题：提纯蛋白质时常用的沉淀方法有哪些?,不可逆沉淀反应,蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。 加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。,问题：这些不可逆的沉淀反应有哪些应用?,蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。 因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。,三、试剂器材,1、实验材料 鸡蛋清 牛奶,2、仪器设备 水浴锅 温度计 锥形瓶 100mL容量瓶 吸管 试管及试管架,0.4% 酪蛋白乙酸钠溶液：取20mL牛奶，加入10mL 1mol/L NaAC,用去离子水定容至100mL 1.00 mol/L 醋酸溶液 0.10 mol/L 醋酸溶液 0.01 mol/L 醋酸溶液,3、试剂,蛋白质溶液：5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清:水=1:9） 0.2M 醋酸-醋酸钠缓冲液，pH4.7 3%硝酸银溶液 5%三氯乙酸溶液 95%乙醇 饱和硫酸铵溶液：25，100mL水76.7g硫酸铵 0.1 M盐酸溶液 0.1 M氢氧化钠溶液 0.05 M碳酸钠溶液 0.1 M醋酸溶液 甲基红溶液：pH变色范围为4.4-6.2，由红变黄,四、实验操作,（一）酪蛋白等电点的测定,（1）取4支试管，按下表顺序分别加入各试剂，混匀。,（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4管的pH依次为5.9、5.5、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊（有颗粒沉淀）的一管pH即为酪蛋白的等电点。,（二）蛋白质沉淀实验,1. 蛋白质的盐析,加5%卵清蛋白溶液5 mL于试管中，再加等量饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。 离心，取沉淀，加少量水，观察是否溶解。 离心后上清液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。 离心，取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀能否重新溶解。,2. 重金属离子沉淀蛋白质 取1支试管，加入蛋白质溶液2 mL，再加3%硝酸银溶液12滴，振荡试管，有沉淀产生。 离心倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？,3有机酸沉淀蛋白质 取1支试管，加入蛋白质溶液2 mL，再加1 mL5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。 离心倾去上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。,4有机溶剂沉淀蛋白质 取1支试管，加入2 mL蛋白质溶液，再加入2 mL 95%乙醇。混匀，观察沉淀的生成。,5乙醇引起的变性与沉淀 取3支试管，编号，依下表顺序加入试剂：,振摇混匀后，观察各管有何变化。 放置片刻，向各管内加水8 mL。在2、3号管中各加一滴甲基红，分别用0.1 M醋酸溶液及0.05 M碳酸钠溶液中和。观察颜色的变化和沉淀的生成。 每管再加0.1 M盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。 解释各管发生的全部现象。,提示：卵清蛋白等电点4.7,实验结果与分析： 按照实验报告要求记录实验结果并分析。 研讨： 通过本次实验，有否对该项目改进的合理建议。 解释盐析、有机溶剂、等电点、重金属、有机酸沉淀蛋白质的不同机理。 查阅资料，介绍蛋白质等电点的测定方法。 查阅资料，介绍生物大分子制备常用的沉淀方法。 蛋白质变性有哪些方面的应用？ 大组总结交流（PPT）： 内容：实验结果与