环氧乙烷残留量气相色谱法分析.ppt

技术中心实验室 2018.06,环氧乙烷残留量分析方法,环氧乙烷,气相色谱的基本概念,气相色谱的结构,EO的测试,气相色谱的维护,其他测试,理化性质： 最简单的环醚 无色气体 沸点：10.4 易爆，易挥发，有醚味。,1.1 环氧乙烷的综述,环氧乙烷对人体的危害 （1）急、慢性毒性 （2）三致作用及生殖毒性 （3）急性中毒与局部刺激 （4）神经系统损害与慢性毒性 （5）致癌作用 （6）生殖毒性,灭菌：EO具有顽强的扩散和穿透能力，对细菌芽孢、真菌和病毒等各种微生物均有灭杀作用，属于广谱灭菌剂。,机理：烷基化反应,1.1 环氧乙烷的综述,残留物： 1. EO Ethylene Oxide 环氧乙烷 2.ECH ethylene chlorohydrin 氯乙醇 3.EG Ethylene Glycol 乙二醇, 一种刺激体表、具有急性毒性，并且在中毒剂量通过皮肤快速吸收的易燃性液体。 轻微的致突变性，具有产生胎儿毒性的潜能。 动物致癌试验：阴性,ISO10993-7:2008 附录I EG无遗传毒性，未显示任何潜在的致癌性 多数材料中EO转化为EG不明显 ，且EG允许限量明显高于EO、ECH 棉花、胶原,参照标准：ISO10993-7:2008,医疗器械环氧乙烷的接触量限度,1.2 环氧乙烷限量,1.3 环氧乙烷分析方法,比色分析法,环氧乙烷在酸性条件下水解生成乙二醇，乙二醇经高碘酸氧化生成甲醛，甲醛与品红亚硫酸试液反应生成产生紫红色化合物，通过比色分析法可求得环氧乙烷含量。,气相色谱法,在一定温度下，用萃取剂萃取样品中所含环氧乙烷（EO），用顶空气相色谱法测定环氧乙烷含量。,1.4 环氧乙烷-浸提方法,浸提方法,模拟使用浸提,极限浸提,定义：用水浸提来模拟产品使用，通过评价患者或使用者在日常使用器械中所接触到的残留物水平。,a)浸提介质：水 b)浸提温度： 整个或部分与人体接触的器械在37浸提，不直接与人体接触的器械在（ 252 ） 浸提； c)浸提时间：应考虑在推荐或预期使用最为严格的时间条件下进行，但不短于1h； d)浸渍表面：器械与药液或血液接触的表面。,短期接触 长期接触,定义：随后的浸提至浸提液中EO或ECH的量小于首次浸提液中10%检出量的浸提，或浸提到测得的累积残留量无显著性增加。,持久接触,包括热极限浸提法和溶剂极限浸提法,通过分析有代表性的“最坏情况”，经动力学研究来掌握一族相似的产品。,1.5 影响环氧乙烷残留量的因素,温度、装载密度和排列、气流、时间,因素,材料组成,涤纶、聚碳酸酯吸附量大,包装材料、包装密度、运输容器的密度,浓度、作用时间、温度、循环类型、湿度、抽真空度与换气次数、产品密度。,通风,灭菌循环,包装,组合包： 选择残留量最大的作为代表 如：导管、纱布、吸液材料、手术衣袖口,1.5 影响环氧乙烷残留量的因素,组合包： 手术衣袖口,分配系数 在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（g / mL）比，用K 表示,分配比 k：质量比，又叫容量因子或容量比,分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。 分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。,2.1 色谱的基本概念-分配系数,2.1色谱的基本概念-分配系数,分配比与分配系数的关系,式中为相比，流动相体积Vm 与固定相体积VS之比,分配比k 与保留时间tR的关系 k的实验求解,2.2 色谱的基本概念,1.基线 无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。 2.保留值：时间或体积,保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间；,死时间（tM）：不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间 调整保留时间（tR ）：tR= tRtM,2.2 色谱的基本概念,3. 相对保留值r21,组分2与组分1调整保留值之比： r21 = tR2 / tR1= VR2 / VR1,相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。,r21 = tR2 /tR1= K2 / K1k1 / k2,2.2 色谱的基本概念,色谱峰为高斯正态分布时，色谱流出曲线为：,用来衡量色谱峰区域宽度的参数，有三种表示方法： （1）标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。 （2）半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度 Y1/2 =2.354 （3）峰底宽(Y )： Y=4 ,色谱柱效参数,2.3 色谱的基本概念-理论,两种色谱理论 塔板理论热力学因素 速率理论动力学因素,塔板理论的假设： (1) 在每一个塔板上，可以迅速建立分配平衡 (2) 将流动相看作成脉动（间歇）过程； (3) 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略 (4) 每次分配的分配系数相同。,2.3 色谱的基本概念-塔板理论,色谱柱长：L， 塔板高度：H， 色谱柱的理论塔板数：n， 则三者的关系为： n = L / H 理论塔板数与色谱参数之间的关系为：,组分在tM时间内不参与柱内分配，需引入有效塔板数和有效塔板高度：,Y,柱效参数： 单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高,Y,2.3 色谱的基本概念-塔板理论,(1) 提出了计算和评价色谱柱效的参数和方法,(2)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。,(3) 无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。,塔板理论的特点和不足,2019/11/13,2.4 色谱的基本概念-速率理论,用速率方程重新定义塔板高度，并提出影响柱效的动力学因素：涡流扩散、分子扩散、传质阻力 速率方程（也称范.弟姆特方程式） H = A + B/u + Cu H：理论塔板高度， u：载气的线速度(cm/s),A 涡流扩散项 B/u 分子扩散项 Cu 传质阻力项,2.4 色谱的基本概念-速率理论,涡流扩散项,A = 2dp dp：固定相的平均颗粒直径 ：固定相的填充不均匀因子,固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，A，H，柱效n，色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。,2.4 色谱的基本概念-速率理论,分子扩散项,B = 2Dg ：弯曲因子， Dg：组分在气相中的扩散系数（cm2s-1）,与组分性质、流速、滞留时间、流动相性质、柱温等因素有关,传质阻力项,2.4 色谱的基本概念-速率理论,k为容量因子； Dg 、DL为扩散系数。 减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。,流动相传质阻力Cg 固定传质阻力CL C =（Cg + CL）,2.5 色谱的基本概念-分离度,塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。 难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保留值之差色谱过程的热力学因素； 区域宽度色谱过程的动力学因素。 色谱分离中的四种情况如图所示：, 柱效高， K(分配系数)较大, 完全分离； K不是很大，峰较窄，柱效高，基本分离 峰宽，柱效较低，K较大,但分离的不好； K小，柱效低，分离效果更差。,2.5 色谱的基本概念-分离度,分离度的表达式：,R=0.8：两峰的分离程度可达89%； R=1：分离程度98%； R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。,2.5 色谱的基本概念-分离度,影响分离度的因素：,理论塔板数n 增加柱效 ，可提高分离度 r21 （或选择因子） 增大r21是提高分离度的最有效方法， 容量因子，分配比,2.5 色谱的基本概念-分离度,k 影响峰位,n 影响峰宽窄,影响两峰间距,2.6 色谱的基本概念-分离条件的优化,载气及其流速,H = A + B/u + Cu， 最佳流速uopt (B/C)1/2,柱温 柱温，分离度，分析时间，综合考虑 复杂，沸程宽的试样，采用程序升温,柱长和柱内径 满足分离目的的前提下，尽可能选用较短的柱,载体 粒度影响柱效,进样方式和进样量,2.7 色谱的基本概念,用回收率表示，至少3个浓度点9个结果。,术语,检出限,一般认为：色谱图上平直基线部分的噪声峰高RN，3倍RN对应的量就是检出限。,基线漂移在最初基线的5%以内,至少5个浓度点，最小相关性宜为0.95（ISO10993-2008） 要求0.99以上。,准确度,相关性,基线,3.1 气相色谱-结构,气相色谱法系采用气体为流动相（载气）流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。物质或其衍生物气化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器，用记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。,采用溶液直接进样时，进样口温度应高于柱温30 50,柱温箱稳定性要求:1，波动0.1/h,火焰离子化检测器（FID）：痕量有机物 热导检测器（TCD） ：水、气体混合物的分析 电子捕获检测器（ECD）：含卤素的化合物 NPD、FPD、MS,检测器温度一般应高于柱温，并不低于150，以免水汽凝结，通常为250350。,色谱柱:填充柱或毛细管柱。（230老化5h）,载气系统包括气源、气体净化、气体流速控和测量 5个9,隔垫 衬管,3.2 气相色谱-操作,毛细管进样系统：InertCap624 0.32mmx30mx3.00m,上海舜宇GC1120,4.1 气相色谱法-定量法,定量法,归一法 适用于试样中各组分都能流出色谱柱，并在色谱图上显示色谱峰。 全部出峰,外标法 精密量取对照品，配制成溶液，注入仪器，记录色谱图对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量：Cx=CRAx/AR,自动进样,内标法 精密取对照品和内标物质，分别配制成溶液，精密取各溶液配成校正因子测定的对照溶液，测量对照品和内标物质的峰面积或者峰高，按下式计算校正因子： （f）=AsCR/ARCs 再取各项中含有内标物质的供试品溶液，测量峰面积。按下式计算含量： Cx=fAxCs/As,例子：EO、ECH,例子： 乙醇（正丙醇） 甲醇（正丁醇） EO（氧化丙烯）,内标物4个注意点： 相近相似；试样中不存在内标物，且完全分离；纯物质或已知含量；互溶，不可逆,不能全部出峰,标准贮备液,测试样品,绘标准曲线,参考标准：ISO 10993-7-2008、GB/T 14233.1-2008,4.2 EO的测试,计算结果,4.3 标准曲线-EO,1、标准储备液的配制 取外部干燥的50mL容量瓶，加入30mL水，称重，记a；用冷却的注射器加入0.2mL环氧乙烷，轻轻摇晃后，盖好瓶盖，称重，记b。前后质量差即为溶液中所含环氧乙烷的质量，加水至刻度线，配成储备液， 该浓度为C1=（b-a）*CEO*103/50 mg/mL。 2、稀释10倍为C2后配置成标样点 3、加热 每个标样取5mL液体，于60下加入40min 4、测试并绘标准曲线,5、举例 a=61.6839 g b=61.8183 g C1=(61.8183-61.6839) x99.5%x103/50 =2.67456 mg/mL =2674.56 g/mL 稀释10倍，C2=267.456 g/mL 取8个100mL容量瓶，配置标样点：,4.4标准曲线-EO,4.4 测试样品,1、制样 将样品透析包装打开，选取易于拆卸、剪取及不易环氧乙烷解析部位，将样品剪成 5mm 碎块，取 1.00g ，置于20mL 顶空瓶，加水5.0mL，密封。 注意： a、做好准备工作 b、组合包中每款产品都检，以“结果最坏的”作为组合包的测试结果 c、稀释合适的倍数 2、加热 样品于60下浸提40min（极限浸提法） 3、测试 4、记录 导入校准表，查看结果,热极限浸提法,绝对含量 WEO=5cm1/m 10-3 （mg） m1 -单位产品质量；m 称样量 相对含量 CEO=5c/m （g/g）,4.4 测试样品,4.4 样品的处理,1、样品的保存,注：验证时，“空白样品”,4.4 样品的处理,2、顶空瓶的处理 测试完的顶空瓶，剪开瓶盖，倒出样品，在自来水下冲洗后，放在盆中，加入肥皂水，于通风橱下浸泡1-2天；捞出清洗干净，在120下干燥2-3h。,注：验证时，“空白样品”,五、气相色谱-维护,a、新的柱子 主要目的：去除键和不够稳定的固定相，让新柱子性能更稳定。 b、多次测试的柱子或测了残留大样品的柱子 主要目的：去残留,T老化=（T方法Max+T耐受Max）/2,老化的第一个重点：老化的最高温度,极性强、膜厚大的柱子通常耐受温度比较低，老化前，需仔细查阅色谱柱包装盒或说明书。,5.1 气相色谱-维护-色谱柱的老化,5.1 气相色谱-维护-色谱柱的老化,老化失败最常见的原因 a、氧气的存在 高温下氧气是破坏化学键的好手，而色谱柱里的固定相一旦破坏，彼此间的键键链会破坏，固定相不能再“稳定”固定在色谱柱中，造成大量柱流失，柱效大幅下降。 处理： 1、把色谱柱末端伸入溶剂中，观察是否有连续的泡沫（查漏） 2、升温前，先通15min氮气 3、确保其它接头，正确安装,c、已使用过的柱子 先分析样品成分，若是在老化温度下也不能被完全气化的成分，如蛋白质、胶状物，在老化前，应先进行色谱柱的维护 换衬管、色谱柱柱头切割,b、新柱子老化，最好不接检测器 FID检测器：可不连检测器、不点火、不开空气和氢气,5.2 气相色谱-维护,3.4.1 气体 FID：氢气为燃气，空气为助燃气 纯度 填充柱：99.99%氮气作为载体 毛细管分析：99.999%氮气作为载气 氢气：安全原因 氦气：灵敏度高，基线噪声非常小，成本过高 定期检查去除来自空气压缩机的空气水分的硅胶和除去有机物的分子筛等 极性强的毛细管柱耐氧化性差，容易因氧化等而变化，因此，尽量装配氧气捕集器除氧。氧气捕集器须定期用氢还原进行再生。 来自空气压缩机的空气不是经常流量一定，流量变动会影响基线，因此，在流路途中增加硅胶管和用于控制流量的波纹管阀，使流量稳定。 3.4.2 柱 柱的使用温度尽量比柱的耐热温度低 除去载气中的氧（特别是使用极性柱时） 使用高纯度气体；气瓶更换时不要混入空气 氧气捕集器装在GC前不要使难挥发的成分进入柱内 充分做好试样的预处理 使用柱衬管和石英棉 安短的一次性使用的前置柱,3.4.3 FID检测器 柱子老化时，不要把柱子与检测器连接，以免检测器被污染，上海舜宇GC1120的色谱柱最高温度为230。 各操作温度未平衡之前将氢气及空气源关闭，以防止检测器内积水。 点火时，不要使按钮按下时的时间过长，以免损坏点火圈。 仪器开机后，应先通过载气再升温，待FID检测器温度超过100时方能点火。,6.1 其他-酒精的测试,1.比重法 适用于仅含乙醇和水的溶液 原理：酒精比重计放入样品溶液中，比重计下按放手，当其