莪术油注射液研究论文

1 / 6 莪术油注射液研究论文 1 材料与仪器 细胞株：人卵巢癌 SKOV3细胞购自中国医学科学院肿瘤研究所 ,由广西肿瘤防治研究所临床中心实验室传代保存。细胞用含有 10%灭活小牛血清、 100 U/ml 青霉素、 100 g/ml 链霉素的 RPMI-1640 培养液于 37 、 5%CO2 条件下培养。 MR-300 酶标仪为美国产 ,倒置显微镜为日本产。 MTT(噻唑蓝 )购自 Sigma公司 ,RPMI1640和小牛血清为 Gibco公司产品，其余均为国产分析纯试剂。莪术油注射液购自黑龙江瑞格制药有限公司（生产批号： 051101,国药准字： H20023314）。 2 方法 2.1 噻唑蓝 (MTT)法确定莪术油注射液对卵巢癌SKOV3 细胞的存活抑制作用 取对数生长期的卵巢癌 SKOV3细胞 ,浓度为 5103 个 /ml，加入到 96孔板，每孔加含细胞的培养液 180 l, 置 37,5% CO2 培养箱孵育 24 h 后 , 以依次加入终浓度为 15.625， 31.25， 62.5， 125， 250 g/ml莪术油注射液 ,同时以 1640培养液作为空白对照组 , 每孔的终体积均为 200 l ，分别培养 12， 24， 36， 48 h 后加入20 l MTT(2 gL -1),37,5% CO2 培养箱孵育 4 h 后 ,弃上清液 ,每孔加入 DMSO 200 l, 于 492 nm 波长处测定吸光2 / 6 度 OD 值，每个浓度平行测定 3 孔。按下列公式求出生长抑制率 (IR)，通过由 IR对浓度作图 ,求出半数抑制浓度 IC50。实验重复 3次取平均值。 生长抑制率 IR（ %） = （ 1-实验组平均 A值 /空白对照平均 A值） 100% 2.2 细胞形态学观察 倒置显微镜观察：细胞爬片后 ,分别加入 31.25， 62.5， 125g/ml 浓度的莪术油注射液作用 48 h后，倒置显微镜观察 ，摄片。 2.3 统计学处理所有数据用 SPSS 11.0 软件进行单因素方差分析分析，计量资料结果以 s 表示，当 P 0.05 认为差异有显著性意义。 3 结果 3.1 MTT 法检测结果 MTT法检测不同浓度、不同时间莪术油注射液对 SKOV3细胞抑制效果，见表 1。 结果表明，莪术油注射液对 SKOV3 细胞体外生长具有明显的抑制作用，其抑制作用随时间、浓度的增加而不断加强，呈现一定的 -时 -效、量 -效关系，其中各浓度药物作用48 h 后的抑制效果最好 ,计算出 IC50=55.16 g/ml 。 a= -0.339 0， b=0.235 6， r=0.927 1。 3.2 倒置显微镜结果（细胞形态学变化）细胞培养 48 3 / 6 h 后观察，空白对照组 SKOV3 细胞生长旺盛，分裂相较多，细胞透明，细胞间连接紧密，密度较大呈复层性生长，部分重叠成簇状，形态多样，多角形或短梭形 ,胞核圆形或椭圆形 ,多突起，具有较好的折光性，胞浆丰富透亮 ,部分细胞内可见分泌颗粒，细胞为梭形或短梭形，细胞内颗粒较少，细胞核隐约可见，培养液中极少见悬浮的死亡细胞以及细胞碎片（见图 1 2）。选择 31.25， 62.5， 125 g/ml 浓度的莪术油作用细胞 48 h 后观察 , 大体可见细胞密度明显减少，胞体变长 ,细胞内颗粒感增强，细胞界限模糊 ,细胞间隙逐渐增宽，细胞质减少 ,胞浆减少 ,细胞脱落呈悬浮状 ,存活细胞减少，细胞核碎裂，可见细胞碎片，随着莪术油作用浓度的增加，上述现象更加明显（具体见图 3 8）。 表 1 莪术油注射液对 SKOV3 细胞增殖的抑制率（略） 不同浓度之间比较的方差分析结果为 F=309.901，组间均为 P 0.01；不同时间各组之间的方差分析结果为F=103.571，组间均为 P 0.01 图 1 人卵巢癌 SKOV3细胞 (100, 细胞镶嵌排列 ,呈栅栏状或成腺趋势生长 ) （略） 图 2 人卵巢癌 SKOV3 细胞 (200 ，显示瘤细胞形态 ) （略） ; 图 3 浓度 31.25g/ ml 莪术油作用后卵巢癌 SKOV34 / 6 细胞显微镜观察图 (100 ， 部分细胞核开始变形，颗粒感增强 ) （略） 图 4 浓度 31.25g/ ml 莪术油作用后卵巢癌 SKOV3细胞显微镜观察图 (200 ， 部分细胞体积增大，胞浆减少，培养液中出现死亡细胞 )（略） 图 5 浓度 62.5 g/ ml 莪术油作用后卵巢癌 SKOV3细胞显 微镜观察图 (100 ，细胞损伤明显加重，细胞核变形明显 ) （略） 图 6 浓度 62.5 g/ ml 莪术油作用后卵巢癌 SKOV3细胞显微镜观察图 (200 ，多数细胞体积增大，胞浆明显减少，培养液中死亡细胞增多 )（略） 图 7 浓度 125 g/ ml 莪术油作用后卵巢癌 SKOV3细胞显微镜观察图 (100 ，核浆比例增大 ,细胞排列极性消失，颗粒感明显 ) （略） 图 8 浓度 125 g/ ml 莪术油作用后卵巢癌 SKOV3细胞显微镜观察图 (200 ，细胞损伤非常明显，细胞质颗粒脱落， 胞浆溶解，培养液中大量死亡细胞和细胞碎片 ) （略） 4 讨论 5 / 6 莪术油作为一种具有良好应用前景的抗癌药物 , 其方便、快捷、经济，日益引起人们的重视 ,成为研究的热点。本实验以莪术油注射液 5 种浓度 ,分别作用于卵巢癌 SKOV3细胞 12， 24， 36， 48 h后 ,发现随药物浓度增加、作用时间延长 ,抑制率也增加。实验表明，药物作用 48 h 效果最明显 ,利用中效方程式计算出 48 h的 IC50 值为 55.16 g/ml ；小剂量莪术油 (15.625 g/ ml) 对 SKOV3 细胞的抑制作用并不明显。用浓度 为 31.25， 62.5， 125， 250 g/ml 莪术油作用 SKOV3细胞 48 h后，其抑制率有明显的量 -效关系； 250 g/ml 的莪术油抑制率高达 86.7%，但是在倒置显微镜下观察可见满视野的细胞碎片，绝大多数细胞坏死，几乎找不到贴壁细胞。因此，选择浓度为 31.25， 62.5， 125 g/ml 的莪术油作用 SKOV3 细胞 48 h 后，主要从细胞体积、细胞质感、细胞浆、细胞质等方面，通过倒置显微镜进行形态学观察：与对照组比较， 31.25 g/ ml 浓度莪术油作用后可见部分细胞核开始变形，颗粒感增强，细胞体 积增大，胞浆减少； 62.5 g/ml 浓度莪术油作用后可见细胞损伤明显加重，细胞核变形明显，多数细胞体积增大，胞浆明显减少，细胞界限模糊； 125g/