染色体免疫共沉淀CHI.ppt

Chromatin Immunoprecipitation(ChIP) Assay,染色质免疫沉淀实验,前言,基因表达是一个十分复杂而有序的过程，它是众多的反式因子和顺式作用元件之间相互作用的结果。 与原核生物不同，真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。 因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核基因表达机制的基本途径。,常用的研究蛋白质与DNA相互作用的方法,1.凝胶电泳迁移率改变分析 （EMSA） 2.DNase足迹法（foot printing） 3.染色质免疫沉淀实验(CHIP),凝胶电泳迁移率改变分析 （EMSA）,在凝胶电泳中，由于电场的作用，小分子DNA片段比其结合了蛋白质的DNA片段向阳极移动的速度快，因此，可标记短的双链DNA片段，将其与蛋白质混合，对混合物进行凝胶电泳，若目的DNA与特异性蛋白质结合，其向阳极移动的速度受到阻滞，对凝胶进行放射性自显影，就可找到DNA结合蛋白 。由于其特异性好，DNA迁移率变动试验常用来鉴定其他方法筛选出的结果,DNase足迹法（foot printing）,蛋白结合在DNA片段上，保护结合部位不被DNase破坏，这样，蛋白质在DNA片段上留下了“足迹”，在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。,凝胶电泳迁移率改变分析 （EMSA）与DNase足迹法均为研究体外DNA与蛋白质相互作用的方法，但不能直接对体内的DNA与蛋白质相互作用进行研究。而CHIP是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。,同时，由于许多转录调控蛋白有相似或相同的DNA结合位点，胶电泳迁移率改变分析（EMSA）获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNA结合的状况。,染色质免疫沉淀分析（ChiP）是基于体内分析发展起来的方法，它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。,CHIP原理,在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。,操作步骤,其操作步骤可大致分为固定、沉淀和检测三步 第一步：固定，即在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质DNA复合物，然后用化学（ 微球菌酶） 或者机械（ 超声波）的手段将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段。,第二步：免疫沉淀，即利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合体，然后沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA 片段。,第三步：目的片段的纯化与检测，即经蛋白质与DNA 解偶联，DNA片段纯化等处理后，用PCR等方法检测DNA与蛋白质的结合情况.,条件选择,1、超声波破碎条件的选择 2、抗体量的选择 3、PCR反应条件的选择,应用,1、组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记” 2、转录调控分析 3、药物开发研究 4、有丝分裂研究 5、DNA损失与凋亡分析,扩展应用,CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围: 1、CHIP 与基因芯片相结合所建立的CHIP-on-CHIP 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选； 2 、 CHIP 与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点; 3 、 RNA-CHIP用于