探讨Notch信号通路对糖尿病大鼠血管平滑肌细胞mRNA影响.doc

探讨Notch信号通路对糖尿病大鼠血管平滑肌细胞mRNA影响 孟凡兵1范东旭2刘丽3金松2 1吉林省长春市解放军461医院吉林省长春市130000 2黑龙江省佳木斯市佳木斯大学附属第一医院血管外科黑龙江省佳木斯市154007 3黑龙江省人民医院血管外科黑龙江省哈尔滨市154000 【摘要】目的：探讨Notch信号通路对体外培养糖尿病大鼠血管平滑肌细胞的mRNA水平的影响。方法：本课题从不同梯度浓度-分泌酶抑制剂(DAPT)干预Notch信号通路后对DM大鼠VSMCs基因影响进行论述。结果：通过实时定量PCR方法分析得出，加-分泌酶抑制剂（DAPT)的培养基的DM大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)溶解温度峰值Tm进行检测得出：溶解曲线呈单峰，溶解温度在86.0-84.0之间，溶解温度变化小，表明为特异性扩增。结论：实验结果显示DAPT干预Notch信号通路后，对体外培养的DM大鼠VSMCs的mRNA有抑制趋势，复制率下降，使其溶解温度峰值前移，溶解曲线呈单峰，将会导致进一步细胞凋亡。 关键词pcr；糖尿病大鼠；dapt；血管平滑肌细胞；mrna 1材料与方法 本课题前期的糖尿病大鼠模型建立、糖尿病大鼠主动脉血管病变检测、糖尿病大鼠VSMCs体外培养及鉴定以及不同梯度浓度-分泌酶抑制剂(DAPT)干预Notch信号通路后对DM大鼠VSMCs活性及毒性、凋亡、细胞周期的影响均已完成，且DM大鼠VSMCs已完成冻存。仅从不同梯度浓度-分泌酶抑制剂(DAPT)干预Notch信号通路后对DM大鼠VSMCs基因影响进行论述。 1.1实验对象 取已完成的糖尿病大鼠血管平滑肌细胞，进行细胞复苏与传代。 1.1.1VSMCsmRNA的抽提 取冻存已裂解的细胞，在常温下放置到完全溶解。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40l用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80，作为实时定量PCR扩增实的模版。 1.1.2RNA质量检测，紫外吸收法测定取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取260nm和280nm两处的吸收值，测定RNA溶液的浓度和纯度。进行浓度测定，在进行纯度检测，mRNA纯度为mRNA溶液的A260/A280的比值，比值范围1.9到2.1. 2反应条件 如表1。 3引物设计软件 PrimerPremier5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补。 根据文献设计出相应的引物。 目标基因： 上游引物为5:TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGCTAT3下游引物为5：GACGACCCCGAACCGCGACCGTAACAG3扩增条目的条带大小为155bp。对照基因： 上游引物5:TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGTTAT3下游引物5：CAAGACCCCGAACCGCGACCGATACCA3扩增条目的条带大小为156bp。 4结果 通过实时定量PCR方法分析得出，加-分泌酶抑制剂（DAPT)的培养基的DM大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)溶解温度峰值Tm进行检测看见：溶解温度在86.084.0之间，溶解温度单一，溶解曲线呈单峰，标明为特异性扩增。而对照组（正常培养基）未见特异性峰值。从PCR溶解曲线我们看见DAPT干预Notch信号通路后对体外培养的DM大鼠VSMCs的mRNA有抑制趋势，使其溶解温度峰值前移，溶解曲线呈单峰，复制率下降，将会导致细胞凋亡。 5结论 本课题通过实时定量PCR技术分析探讨Notch信号通路在糖尿病大鼠血管再生及成熟中的作用机制，分析探讨Notch信号通路对体外培养糖尿病大鼠血管平滑肌细胞的mRNA水平有何影响，为进一步研究糖尿病患者血管再生提供依据，有可能成为获得更多有功能的血管以促进血管新生，为临床治疗糖尿病足溃疡、缺血性疾病、改善预后提供新思路和新途径，并为以后系统科学地研究血管再生提供方向，为缺血性疾病的治疗提供靶向药物，希望在不久之后会应用到临床治疗中，造福广大糖尿病足溃疡、缺血性疾病患者，实现从实验室到临床的完整对接，进一步提升糖尿病足溃疡、缺血性疾病治疗的基础研究水平。 （通讯作者：金松） 参考文献 1金松,刘延东.糖尿病大鼠血管平滑肌细胞体外培养及Notch信号通路对其营养的研究J.佳木斯大学学报,xx3-5. 2吴护群,陈戈,卢文.糖尿病足的基础知识教育及防治J.实用心脑费血管病杂志,xx,18:57. 3SteeperR.AcriticalreviewoftheaetiologyofdiabetieuropathiculcerJ.JWoundCAre.xx,14(3):101-103. 4林楚佳,林少达，黄少薇。糖尿病足下肢血管病变分析J.中国临床研究，xx,24(4):274-276. 5杨婷,金松,刘延东.糖尿病大鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良J.中国普外基础与临床杂志，xx,20(2):173-176. 6黄留玉PCR最新技术原理,方法及应用M北京：化学工业出版社,xx;131-157. 7罗勇军，刘欣，实时荧光定量PCR标准品的制备及应用J.重庆医学,xx,34（30:414-415. 8管任珍.实时荧光定量PCR检测胃癌DNA甲基化J.天津医科大学学报,xx-03-023-5. 9梁洁，韩骅.Notch信号通路与血管发育J.细胞与分子免疫学杂志,xx-12-18，26-27. 10MorrowD,GuhaS,SweeneyC,Notchandvascularsmoothmusclecellphenotype.CircRes,xx.103(12)1370-82. 11StockhausenM，SjolundJaxelso