关于免疫功能检验方法的研究现状.doc

关于免疫功能检验方法的研究现状 李娜1矫健2姜素云1窦德强2 1.大连市食品药品检验所,辽宁大连116021;2.辽宁中医药大学，辽宁大连116000 摘要生物机体在种系进化和个体发育过程中逐步获得的防卫能力即为人体的免疫功能，此功能过低或过高时，都会导致对外源性抗原或内源性抗原发生免疫调节失常。该文综述了目前国内外免疫功能检验的一些方法，以期寻找特性确定、高效、稳定、无毒的理想免疫剂应用于临床。 关键词免疫；功能检验方法 R446A1674-0742(xx)03(a)-0193-03 作者简介李娜(1987-)，女，黑龙江绥化人，硕士，主要研究方向:药理学，邮箱:921888804qq.。 通讯作者姜素云，女，主任药师，研究方向：药理学,E-mail：syjiangsy263.。 常常用亢进或低下来描述机体的免疫功能，对于机体来说亢进、低下都是有害的。人的身体健康与否，取决于机体的免疫功能是否能达到免疫功能的相对平衡，即保持相对的自身稳定。该文综述了目前国内外对免疫药物功能检验的一些方法，以期为免疫药物的进一步研究和质量控制提供参考。 1免疫器官功能测定 小鼠称重，取胸腺、脾脏，称湿重，计算脏器指数，根据胸腺指数和脾指数是否升高来判定受试物对机体免疫的调节能力1。 2细胞免疫功能测定 2.1MTT法 1983年Mosmann2用MTT显色反应法检测细胞增殖细胞中线粒体内酶还原MTT形成兰紫色的甲臜，甲臜的量与细胞增殖程度呈一定关系，此法简便、快速、准确但是不够稳定。1994年，董德平等3对MTT比色法的条件进行了探讨，发现甲臜溶解剂易引起蛋白沉淀，得出DMSO是一种较为理想的甲臜溶解剂。2000年，赵承彦等4对MTT法显色条件进行了分析，认为MTT反应体系在pH值为6.7，Formazan溶剂是正丙醇、异丙醇和乙二醇乙醚时有很好的灵敏性和稳定性。去掉细胞培养上清，检测细胞上的酶，用溶剂使蛋白质变性，经沉淀去掉蛋白质影响，能使MTT实验方法的本底降低，也可以提高灵敏度MTT比色法无需特殊仪器，且操作简便快速准确，国内外大多采用该法。 2.2同位素掺入法 同位素掺入法原理是有丝分裂原PHA、ConA等刺激T淋巴细胞产生增殖反应，明显增加DNA和RNA合成，如将H3-胸腺嘧啶核苷(H3-TdR)加入到培养液中,则可被转化中的细胞摄入，淋巴细胞增殖的程度可由测定标记淋巴细胞的放射强度反映出5。原材料成本高，设备价格高，且易对环境造成污染是此方法的缺点。徐淑云6报道了MTT比色法与3H-TdR渗入法两法比较试验表明，两种方法平行相关，MTT比色法具有简单、快速、敏感的优点。但是MTT方法只能检测已形成的细胞,而同位素标记法能检测细胞形成的初期即DNA合成的启动阶段,结果准确7。 2.3迟发型变态反应(DTH) 70年代初期，有学者8-9用特异抗原诱导测定脚掌或耳肿胀来表示DTH。后来，Hartley10提出了用绵羊红细胞抗原致敏，然后在尾中部皮下进行攻击注射，通过测定尾部肿胀程度来表示DTH，该法有较高的重复性和可靠性。现在多数实验6都用1%丙酮麻油致敏，5d后，测耳肿胀度来表示DTH。DTH实验方法简便，但是在实验过程中，致敏范围和打孔位置是否一致，对实验的结果有影响。 3体液免疫功能测定 3.1抗体生成细胞检测 1963年，Jerne11首先建立了溶血空斑实验。1964年，Ingraham和Bussard12利用半固体介质将其改良成琼脂与致甲基纤维素溶血空斑平板法。1965年，Cunningham等13利用载玻片制作小室改良成单片玻片小室溶血空斑法。1973年，Sulitzeam和Marbrook14发现了琼脂或琼脂糖溶血空斑玻片法。1975年，Simpson和Gozzo15根据溶血空斑原理将其改良成淋巴介导红细胞的分光光度法，将免疫脾细胞(对照用正常脾细胞)，SRBC和补体在液相介质中进行反应，观察红细胞被抗体生成细胞产生的IgM所裂解，而释放的血红蛋白量，用分光光度计作定量测定，据此推知抗据此推知抗体生成细胞多少。1976年，Gronwicz等16通过加入针对产生免疫球蛋白细胞供者的Ig的抗体，从而细胞产生的免疫球蛋白结合形成复合物，复合物上的Fc片段可与连接在SRBC上的SPA结合，同时激活补休使SRBC溶解形成空斑即葡萄球菌A蛋白SRBC溶血空斑法。以上各种方法各有优缺点，实验者应根据实验目的选择合适的方法。 3.2血清溶血素的测定 血清溶血素的测定有血凝法和半数溶血值2种测定方法。血凝法用SRBC免疫动物后，抗SRBC抗体(溶血素)产生，利用其凝集SRBC的程度来对溶血素的水平进行检测5。1979年，徐学瑛17报道了小鼠血清溶血素测定法。1999年，雷林生18等将含有溶血素的血清样品适当预稀释,然后取100l加入96孔板中进行有限的倍比稀释来测定小鼠血清溶血素的活性。该法准确可靠、重复性好。半数溶血值(HC50)用SRBC免疫动物后，血清中出现SRBC抗体(溶血素)，发生溶血反应，释放血红蛋白，通过测定血红蛋白含量反映血清中溶血素的含量5。 4巨噬细胞功能测定 4.1小鼠腹腔巨噬细胞吞噬细胞实验 徐淑云介绍用新鲜鸡红细胞作为吞噬物，半体内法测定小鼠吞噬功能。1989年，陈逐19又对其进行了改进，将鸡红细胞进行醛化并省去体内孵育步骤，此法提高了吞噬率和实验的稳定性。后又有学者20在实验前24h用淀粉刺激巨噬细胞渗出，并于注射临时配制的鸡红细胞30min后观察实验结果，也取得了良好的效果。但是巨噬细胞吞噬能力经小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验检测，需要操者显微镜下计数，存在效率低、工作量大、受主观影响大的缺点。xx年，王辉等21又提出了腹腔巨噬细胞吞噬乳胶颗粒的试验作为一种替代方法,与传统方法比较可以减少鸡红细胞的使用,该法操作简单，结果准确。 4.2流式细胞技术(FCM) 1982年Steinkamp首创荧光微球流式细胞术定量检测吞噬功能。上世纪8090年代期间，许多学者24-26用流式细胞仪检测了中性粒细胞的吞噬功能。20年代初期,陈卫国等27用绿色荧光蛋白基因转染方法标记大肠埃希菌,用于观察PMN吞噬细菌动力学,但该方法操作麻烦又不够准确。xx年，Gaforio等28用SYTOXGreen染料标记大肠埃希菌,用流式细胞仪检测PMN的吞噬功能，但是价格昂贵。xx年，赵修春29等用流式细胞术检测小鼠PMN吞噬FITC标记大肠埃希菌，该法快速、简便、重复性好。流式细胞仪方法一次获取10000个细胞,相比于镜下肉眼观察计数100个细胞,大为提高了检测样本的代表性,实验结果的精度也更为可靠和保证。采用流式细胞术检测巨噬细胞吞噬功能的方法不仅准确、灵敏,更为重要的是它的高通量的特点使检验效率大大提高了,检验过程中人为主观因素的影响减少了30。因此,无论是考虑方法的精确度、灵敏度,还是提高检验效率等因素,保健食品或相关物质增强免疫力功能的评价采用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球实验有很好的应用前景31。 5单核-巨噬细胞功能测定 单核巨噬细胞系统是机体最重要的防御系统,它吞噬某些可溶性异物或异体颗粒的能力强大而迅速,并能将体内自身产生的某些有害物质迅速清除。保健食品检验和评价技术规范5中给予墨汁途径为小鼠尾静脉，但是由于小鼠尾静脉细小及季节环境对小鼠影响较大，严重影响实验结果。有学者22-23认为通过小鼠内眦静脉注入墨汁，其操作简单，成功率高。小鼠碳廓清实验操作容易,初学者可很快掌握,不需特殊条件,易为一般实验室所接受,为免疫调节剂的体内试验研究提供了较为稳定而方便的方法。 6NK细胞活性测定 6.1同位素释放法 自90年代以来，国内外大都采用51Cr释放试验，该法灵敏度高，操作方便，测定迅速并且能够定量分析，但51Cr具有半衰期短和放射性等缺点32。也有用125I-Udr释放法，该法自然释放率低但是需要酶处理且价格贵。目前使用较多的是3H-Tdr释放法，该法突出的优点是半衰期长，缺点是非特异标记高及污染环境。 6.2乳酸脱氢酶(LDH)测定法 1983年，KorzeniewskiC33报道了LDH释放法，该法测定迅速准确，自然释放率低。又有学者34在原法的基础上将它的效靶比、反应时间和表面活性剂加以改进以利于LDH更好的应用。20年代初期，刘家国35等提出了几个影响NK细胞活性的主要因素，认为各实验室之间统一检测程序可提高结果的可比性。相比于免疫常用方法51Cr释放法,LDH测定法具有不存在同位素污染和操作省时等优点,但影响此法的因素较多，实际操作不易掌握7。现在国内大多采用乳酸脱氢酶释放法，但表现出敏感性低的缺点,从而期待发展敏感、特异、安全、简单、快捷的检测细胞毒活性方法。 6.3化学发光法 顾依平36报道对NK细胞杀伤肿瘤细胞前后ATP水平(表现为化学发光强度)的动态变化检测应用了虫荧光素酶,借以对NK细胞的免疫活性进行检测。 7结语 免疫功能检验不能用简单的理化分析与仪器分析的方法进行测定。目前所报道的诸多方法也是各有所长，在实际检测中应根据情况采用两种或两种以上的方法进行，以使研究结果的准确性与可靠得到保证性。随着人们对免疫药物的不断深入研究，检测药物对免疫系统的各种代表性指标的改变可对增强免疫力作用的功能做出相应判定。 参考文献 1李仪奎.中药药理实验方法学M.上海:上海科学技术出版社,1991,155-156. 2MosmannT.JimmunolMethods,1983,65:55. 3董德平,许文荣,赵家宏,等.MTT比色测定淋巴细胞增殖的反应J.镇江医学院,329-330. 4赵承彦,靖志安,牛青霞.MTT显色反应实验条件分析J.河南医学研究,2000,9(2):107-111,116. 5保健食品检验与评价技术规范M.北京:中华人民共和国卫生部,xx,22-34. 6徐淑云,卞如濂,陈修.药理实验方法学M.3版.人民卫生出版社,xx:1426-1457. 7李磊,杨雨晗,王双,等.细胞活性检测方法之比较J.生物学杂志,xx,28(1):87-90,93. 8KettmanJ.ImmunalCommun,1972(1):280. 9PhanuphakP,MoorheadJW,ClamanHN.ToleranceandcontactsensitivitytoDNFBinmice.I.InvivodetectionbyearswellingandcorrelationwithinvitrocellstimulationJ.JImmunol,1974,112(1):115-23. 10HartieyLW.JImmunalMeth,1983,(58)255-262. 11Jerne，N.K.andNordin，A.A.1963.Science.140:405. 12IngrahamJS,BussardA.Applicationofalocalizedhemolysinreactionforspecificdetectionofindividualantibody-formingcellsJ.JExpMed,1964(119):667-84. 13CunninghamAJ.Amethodofincreasedsensitivityfordetectingsingleantibody-formingcells.J.Nature,1965,207(5001):1106-7. 14SulitzeanuD,MarbrookJ,HaskillJS.DirectconversionofprecursorsofPFCsintoactivePFCsinvitro,withoutpriorcelldivisionJ.Immunology，1973,24(4):707-10. 15SimpsonMA,GozzoJJ.SpectrophotometricdeterminationoflymphocytemediatedsheepredbloodcellhemolysisinvitroJ.JImmunolgicalMethods，1978,21(1-2):159-65. 16GronowiczE,CoutinhoA,MelchersF.Melchers.AplaqueassayforallcellssecretingIgofagiventypeorclass.J.EueJImmunol,1976(8):588-90. 17徐学瑛,李元,许津.一个改进的体液免疫测定方法溶血素测定法J.药学学报,1979,14(7):143. 18雷林生,孙丽莎,杨淑琴.有限稀释微量溶血法测定小鼠血清溶血素的活性J.中国药理学通报,1999,15(3):274-276. 19苏东明，武学洲，陈逐,等.小鼠巨噬细胞功能检测方法的改进J.中国学术期刊电子出版,1994-xx,212. 20付绍玲.小鼠巨噬细胞吞噬功能测定实验方法探讨J.湖北民族学院学报医学版,xx,25(4):48. 21王辉,雷志明,郝卫东.小鼠腹腔巨噬细胞吞噬乳胶颗粒实验条件筛选J.中国公共卫生,xx,25(6):719-720. 22连祥霖.钼对氯化汞毒性的影响J.工业卫生与职业病,1995(21):151-152. 23王红梅,马玲,吴少单,等.比较两种墨汁注射途径对免疫低下小鼠廓清实验的影响J.中国食品卫生杂志,xx(15):314-316. 24SahlinS,HedJ,RundquistI.DifferentiationbetweenattachedandingestedimmuneplexesbyafluorescencequenchingcytofluorometricassayJ.JImmunolMethods,1983,60(1-2):115-124. 25WhiteOwenC,AlexanderJW,SramkoskiRM,etal.RapidwholebloodmicroassayusingflowcytometryformeasuringneutrophilphagocytosisJ.JClinMicrobiol,1992,30(8):2071-2076. 26DrevetsDA,ElliottAM.FluorescencelabelingofbacteriaforstudiesofintracellularpathogenesisJ.JImmunolMethods,1995,187(1):69-79. 27陈卫国,洪志刚,何冬红,等.用基因标记技术实时观察中性粒细胞吞噬病原体J.中华检验医学杂志,2000,23(3):141-143. 28GaforioJJ,SerranokMJ,OrtegaE,etal.UseofSYTOXGreendyeintheflowcytometricanalysisofbacteria