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nm23H2抗体对C6神经胶质瘤细胞MMP2蛋白表达量及磷酸化的影响 林超艾文兵熊志云彭智冯定坤孙欢 三峡大学医学院神经外科，湖北宜昌443000 摘要目的探讨nm23-H2抗体对C6胶质瘤细胞MMP-2蛋白表达量及其磷酸化的影响，并探讨其意义。方法将C6细胞常规培养后,按加入nm23-H2抗体的浓度分对照组（0mg/L）、低浓度组（20mg/L）和高浓度组（40mg/L）3组，通过采用免疫组化、Western法检测C6细胞中MMP-2蛋白表达量及磷酸化的变化。结果Western结果显示，各实验组中，MMP-2表达量及其磷酸化程度随nm23-H2抗体浓度的增高呈降低趋势，表现为剂量依赖性关系，3组相互比较，差异有统计学意义（P0.05）。免疫组化结果显示：对照组MMP-2阳性细胞数为（61.606.60）%，低浓度组为（31.005.94）%，高浓度组为（17.576.15）%，3组相互比较，差异有统计学意义（P0.05）。结论nm23-H2对C6细胞MMP-2蛋白表达量及磷酸化起调节作用，使用特异性抗体对其拮抗后，MMP-2蛋白表达量及磷酸化水平均呈下降趋势。 关键词nm23-h2；神经胶质瘤；mmp-2 R73A1674-074（4）12（a）042-02 现已研究发现，nm23-H2是Rho-GTPases/nm23信号通路的重要分子，可通过影响Rho蛋白的活性而干扰细胞的侵袭1；由于上述胶质瘤细胞的侵袭行为与MMP-2同样有重要的关联。因此，nm23-H2在细胞内是否可以通过影响MMP-2而发挥作用有待进一步探索。该研究xx年27月间采用不同浓度的nm23-H2抗体处理C6细胞，观察其对MMP-2蛋白的表达量及其磷酸化的影响，并探讨其作用机制，以期为脑胶质瘤的治疗提供实验依据，报道如下。 1材料与方法 1.1材料 实验自xx年2月开始，xx年7月结束。C6细胞由华中科技大学免疫学教研室提供；nm23-H2抗体；抗MMP-2抗体，HRP-羊抗兔LgG等均购自武汉博士德生物有限公司，纤连蛋白、新生小牛血清及常规生化试剂、仪器设备均由三峡大学分子生物学实验室提供。 1.2方法 1.2.1细胞培养与分组大鼠C6细胞常规培养，待其进入对数生长期后，调整细胞培养浓度为11041105/mL，并按nm23抗体加入的浓度分为对照组（0mg/L）、低浓度组（20mg/L）和高浓度组（40mg/L）3组。20h后收集细胞样品，并加入0.4mLRIPA裂解液，取上清备用。 1.2.2WesternBlot法检测C6细胞中MMP-2蛋白样品行SDS-PAGE，电转移于PVDF膜上，常规封闭液处理2h，依次加入一抗（抗MMP-2抗体12000稀释，和羊抗兔二抗（13000），室温作用1h后显影。ImageJ软件检测各组MMP-2、磷酸化的MMP-2、-actin平均光密度比值均数。 1.2.3免疫组化法检测C6细胞中MMP-2蛋白表达调整C6细胞浓度为1104/mL，依次加入不同浓度的nm23-H2抗体，后依次滴加MMP-2一抗（12000）、IgG二抗，于室温孵育12h。后加入SABC试剂，PBS漂洗后DAB显色，切片在高倍镜下观察并计数。 1.3统计方法 采用SPSS19.0统计软件对数据进行处理，所有数据以均数标准差（xs）表示，进行t检验。 2结果 2.1Westernblotting法检测nm23-H2抗体对C6细胞MMP-2蛋白表达量及磷酸化的影响 如图14所示，不同浓度nm23-H2抗体对MMP-2的表达量及磷酸化均有明显抑制作用，随着浓度的增加，其对MMP-2蛋白表达及磷酸化的抑制作用呈增强趋势。 图1、2所示，随着nm23-H2抗体浓度的升高，MMP-2蛋白表达量及磷酸化均呈下降趋势，图3、4均为内参。注：1为对照组，2为低浓度组（20mg/L），3为高浓度组（40mg/L）。 2.2ImageJ软件检测各组MMP-2、磷酸化MMP-2、-actin蛋白条带平均光密度比值均数 随nm23-H2处理浓度的增加，MMP-2蛋白及磷酸化MMP-2/-actin光密度比值呈下降趋势，3组相比，差异有统计学意义（P0.05)，见表1。 2.3免疫组化法检测nm23-H2抗体对胶质瘤细胞MMP-2表达的影响 随nm23-H2处理浓度的增加，细胞MMP-2阳性细胞数减少，且效果与剂量呈正相关。3组相互比较，差异有统计学意义（P0.05)，见表2。 3讨论 现已发现，Rho-GTPases/nm23是一种新近发现的脑胶质瘤信号通路，该通路所涉及的蛋白表达量与细胞的恶性程度密切相关。已证实，通路中的核心蛋白nm23-H2具有3种酶的活性作用：组氨酸蛋白激酶、二磷酸核苷激酶、3-5核酸外切酶活性2。对多个胞内外蛋白存在影响3。该结果显示，MMP-2表达量及其磷酸化程度随nm23-H2抗体浓度的增高呈降低趋势，表现为剂量依赖性关系，且差异有统计学意义（P0.05）。目前研究认为，在众多肿瘤的恶性生长过程中，MMP-2的激活是最关键的环节之一。其本身磷酸化的程度直接关系到蛋白的活性状态，与MMP-2部分基团的甲基化同等重要4。在该研究结果提示MMP-2可能受nm23-H2上游的干扰和调控。免疫组化的结果显示：对照组MMP-2阳性细胞数为（61.606.60）%，低浓度组为（31.005.94）%，高浓度组为（17.576.15）%，3组相互比较，差异有统计学意义（P0.05）。与Western检测结果基本吻合。国内外其他学者也发现，当有效抑制nm23-H2活性后，可明显抑制肿瘤细胞向周围组织的侵袭。由于nm23-H2在细胞内的浓度不同，对肿瘤细胞中MMP-2的干预作用自然不同5。MMP-2在胞浆升的高表达往往提示肿瘤可能早期就已侵袭正常组织。其次，在胶质瘤的生长微环境下，随着MMP-2等蛋白表达的增强，不仅可以增强细胞自身的侵袭性生长，并可以诱导细胞基质的广泛破坏，二者之间可以相互作用，共同促进肿瘤细胞恶性生物学行为6。该实验研究也同样证明了这一点。 其他学者通过免疫组化等方法证实：nm23-H2与同家族的nm23-H1不同，其关键点在于：nm23-H2可通过结合C-myc基因启动子中的NHEIII1区域的G4序列，从而激活C-myc7-8。通过后者进一步完成相应的生物学作用。该实验中，将不同浓度的nm23-H2抗体与C6细胞共培养，研究在Rho-GTPases/nm23通路中，nm23-H2所能发挥的作用。该研究证实，nm23-H2抗体通过对nm23-H2的抑制，可以在一定程度上，降低MMP-2蛋白的表达及磷酸化程度，表明nm23-H2与MMP-2蛋白之间必然存在某种联系，说明二者很有可能在上游蛋白水平存在调控机制，基因水平的调控及转录后的修饰过程中可能存在影响，有待我们后期进一步研究。 参考文献 1艾文兵，陶胜忠，薛德麟.人脑胶质瘤中VEGF和整合素v3的表达及相关性研究J.肿瘤防治研究,xx,32(2):70-72. 2李宗河，何学令腺病毒介导的nm23h1对人恶性黑色素瘤A375体外抑制作用的研究J.国外医生，xx，32(6):273278 3罗猛,朱大兴,弓磊.nm23-H1基因的肺癌细胞株的建立及生物学行为改变J.中国肺癌杂志，xx,15(3):139-145. 4管孝臣，秦文星.肿瘤转移抑制基因的作用及临床意义J.实用临床医药杂志，xx，15(7):142144 5付军，刘晓梅，陈忠平.mTOR信号通路调控CD133阳性胶质瘤干细胞自我更新的分子机制J.中国神经肿瘤杂志，xx,8(2):75-81. 6汤少鹏，梁庆正.食管癌患者血清中MMP-2和M