中药微生物转化的研究.doc

中药微生物转化的研究 吴思 （湖北职业技术学院，湖北孝感432100） 基金项目：湖北职业技术学院校级课题（xxB06）。 微生物转化中药是指利用微生物产生的酶系作用于中药底物,以期产生新的活性成分,提高中药药效,降低中药不良反应,去除中药中的大分子杂质和将其作为研究药物代谢机制的辅助手段。由于其具有周期短、成本低、区域和立体选择性强、反应条件容易控制、对周围环境影响小等特点,且能够产生一些化学法难以生成的产物,因此近年来,微生物转化方法已经受到研究者的广泛重视,并正迅速地发展。通过先导化合物经生物转化方法寻找新的高活性、低毒性的药物已成为有效开发新药的一条途径。 微生物转化中药的本质是利用微生物体系产生的酶对外源性中药底物进行结构转化的生物化学过程1。微生物转化中药具有以下特点:(1)微生物转化酶系广泛。微生物在生长过程中会产生多样的酶系,如纤维素酶、木质素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂酶等,目前已发现了3000余种能催化各种化学反应的酶2。微生物丰富而强大的酶系构成了高效生物催化体系的核心,且微生物的酶系所催化的反应很多是一些化学合成难以进行的反应。(2)反应选择性强。具体来讲主要包括化学选择性、非对映异构体选择性、区域选择性、面选择性、对映异构体选择性以及立体选择性3,同时微生物转化修饰中药底物某一基团时对不需要转化的基团无需保护,显示出极高的选择性。(3)反应条件温和。由微生物所介导的转化反应一般都在常温、常压下进行,运行操作的设备也比较简便,产生的公害少,一般不造成环境污染,后处理也很简单。中药底物在转化过程中可以最大限度地保护中药中活性成分免遭破坏,可有效解决中药在煎、煮、蒸、浸等传统工艺中活性成分难以最大限度提取的难题。(4)优化条件可使转化率提高。微生物转化中药底物的过程中易受到底物溶解度低,底物和产物抑制微生物酶活性和产物进一步降解等影响。为了提高转化率,可以从诱导物和底物的添加,表面活性剂的添加,碳源、氮源、无机盐,微量元素和酶的抑制剂以及微生物细胞和酶的固定化,反应体系等方面进行选择优化。此外,微生物转化中药的反应可以被看作微生物发酵过程,所以可以连续进行。同时由于设备和原料简单易得,生产成本较低,可进行工业化规模生产。 很多菌种都能使多种化合物发生不同的反应,这些菌种主要是霉菌、酵母菌和细菌,其中又以霉菌在文献中特别常见。微生物转化主要涉及了羟基化、环氧化、脱氢、加氢、水解、酯化、脱水等各类化学反应,还有些代谢产物在转化过程中发生了很复杂的化学反应,人们可以通过这些反应寻找新的有药用价值的衍生物,也可以寻找使这些反应发生的微生物的酶,进而用于工业化生产。本文将从微生物转化的反应类型展开讨论，阐述微生物对中药的生物转化作用。 1羟基化 20世纪50年代首次用黑根霉(Rhizopusnigricans)将黄体酮转化为11-羟基黄体酮,使人们开始意识到微生物转化在制药工业中的重要性,从此微生物转化技术在药物工业生产中成为不可或缺的一种方法。羟基化是微生物转化中最常见也最重要的一种反应,羟基化反应可以发生在多个位置,生成多种有意义的衍生物。尤其是甾体药物,特别是位的羟基化产物,在甾体制药工业中发挥着重要作用。比如甾体的7-羟基化衍生物可以用于利尿剂的生产,但用化学方法合成很困难,文献4报道利用菌种Botrytiscinerea使睾丸激素等几种甾体化合物生成7-羟基衍生物,研究发现在不同孵化期转化的甾体化合物不同，经过5天的孵化主要代谢物是第7-hydroxytestosterone（76收益率），经过6天的孵化主要代谢物是7-羟基-17-甲基睾酮（82收益率），经过6天（以及孵化后10天）的主要代谢产物是10-羟基-19-去甲雄基-4-烯-3,17-二酮（78收益率），经过10天的孵化转化的主要产品是14-羟基-1-脱氢睾酮（68收益率），经过11天的孵化转化的主要产品是7-羟基-1-脱氢-17-甲睾酮（52收益率），可以看出，菌种Botrytiscinerea能够非常有效地使睾丸激素等几种甾体化合物生成7-羟基衍生物，而且产量很高。 不仅是甾体化合物,其他化合物的羟基化代谢产物同样具有重要的应用意义。如ent-kaur16-en-19-oicacid,一种二萜类化合物,具有刺激植物生长的活性。利用菌种Rhizopusstolonifer转化此化合物,7d后产生2种代谢产物,其中一种产物也是7位发生羟基化,该产物可以作为赤霉素生物合成和一种植物生长激素的中间体。 2脱氢反应 脱氢反应,一般主要是指化合物脱氢生成双键。氯化孕酮醋酸酯(chlormadinoneacetate),一种治疗前列腺疾病的抗雄性激素药品,文献5用Arthrobactersimplex和Bacillussphaericus这2种菌使其发生了脱氢反应生成双键,反应所得产物为脱氢氯化孕酮醋酸酯(delmadinoneacetate),这种产物不但和氯化孕酮醋酸酯一样,是治疗前列腺疾病的抗雄性激素药品,还是合成乙酰环丙氯地孕酮(cyproteroneacetate)的前体,而乙酰环丙氯地孕酮因为有抗雄性激素的活性而被广泛的用作孕激素药品,它可以避孕和治疗前列腺癌。文中研究了利用单节杆菌ATCC6946和球形芽孢杆菌ATCC13805自由和固定化细胞在液液两相体系和脂质体中对氯地孕酮醋酸酯的微生物转化。对于液液两相体系，正癸烷，正辛醇，氯仿和醋酸丁酯作为有机溶剂。脂质体由氯地孕酮醋酸包埋在磷脂和胆固醇的脂质体组成。对于这两种生物催化剂固定化和自由悬浮，产量在水溶液中高于在液液两相媒体。在所有情况下，水系统获得的产量最高。在水介质中，从单节杆菌悬浮液中3小时可以获得48%的产率，从球形芽孢杆菌悬浮液中48小时可以获得47%的产率。除了脱氢生成双键,还有实验发现6,利用RhodocouserythropolisDCL14可以使香芹醇脱氢生成香芹酮。 3支链的降解 利用微生物选择性的使支链降解,可以得到有用的化合物中间体,这也是生物转化在制药及其他化工工业生产中的一大用处,具有非常广阔的应用前景。雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-AD)和雄甾1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)就是生产性激素等甾体药物的重要中间体,利用菌种Mycobacteriumsp.NRRLB-36837即可将胆固醇侧链降解生成这2种化合物。文献8同样都以氢化可的松作底物,用不同菌种却得到相似的结果,2个实验都出现了支链降解产物。文献9的实验中得到的2种支链降解产物,一种与文献8得到的产物相同,而另一种则是前者产物的17位羟基变成了酮基。如果这2个菌种都可以选择性的降解氢化可的松类似物的支链,将可能找到更多的所需的中间体。 4酯化反应和水解反应 桉烷型化合物大部分都含有乙酸酯结构,在代谢过程中,虽然所用的菌种不同,但几乎所有的底物都产生了酯基水解的代谢产物。而与水解反应相对,作者也同样发现乙酸酯化反应也比较容易出现在代谢产物中10。在酯化反应中,作者发现密叶辛木素(confertifolin),经过转化后生成2种代谢产物,其中主产物是3-羟基化密叶辛木素,而另一种代谢产物则是3-乙酸酯化密叶辛木素。很有可能这两个产物是由一条代谢途径来完成的,这一推测可能为合成有用的酯类化合物提供了捷径。 5环氧化 环氧化反应在转化的过程中也很普遍,多发生在化合物的双键部位,尤其在萜类中常见,除环氧化反应,双键部位也很容易形成邻二醇结构,没药醇11(-)-bisabolol一种单环倍半萜类化合物,它在Glomerellacingulata作用下生成的几种代谢产物就是这一类反应的典型代表。还有前面提到的ent-kaur-16-en-19-oicacid,其在培养15d后又出现一种代谢产物ent-16,17-dihydroxy-kauran-19-oicacid,这个代谢过程发生的化学反应使16,17位双键生成为（下转第91页）（上接第84页）邻二醇结构。 参考文献 RUANXiaodong,ZHANGHuiwen,CAIYingzhui,etal.ApplicationinbiotransformationofChinesemateriamedicabymicroorganismsJ.ChineseTraditionalandHerbalDrugs,xx,1(40). UrlacherV,SchmidRD.Biotransformationsusingprokary-oticP450monooxygenasesJ.CurrOpinBiotechnol,xx,13(6):557-564. RoDK,ParadiseEM,OuelletM,etal.ProductionoftheantimalarialdrugprecursorartemisinicacidinengineeredyeastJ.Nature,xx,440(7086):940-943. EwaHuszcza,JadwigaDmochowska-Gladysz.TransformationsoftestosteroneandrelatedsteroidsbyBotrytiscinereaJ.Phytochemistry,xx,62:155-158. JiradejManosroi,PattanaSripalakit,AranyaManosroi.BiotransformationofchlormadinoneacetatetodelmadinoneacetatebyfreeandimmobilizedArthrobactersimplexATCC6946andBacillussphaericusATCC13805J.EnzymeandMicrobialTechnology,xx,33:320-325. CarlaSofiaRTecelao,FrederikvanKeulen,MManuelaRdaFonseca.Developmentofareactionsystemfortheselectiveconversionof(-)-trans-carveolto(-)-carvonewithwholecellsofRhodocouserythropolisDCL14J.JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic,xx,11:719-724. ZhilongWang,FengshengZhao,XueqinHao,etal.MicrobialtransformationofhydrophobicpoundincloudpointsystemJ.JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic,xx,27:147-153. MohammadAliFaramarzi,MojtabaTabatabaeiYazdi,AbbasShafiee,etal.MicrobialtransformationofhydrocortisonebyAcremoniumstrictumPTCC5282J.Steroids,xx,67:869-872. MojtabaTabatabaeiYazdi,HomeiraArabi,MohammadAliFaramarzi,etal.BiotransformationofhydrocortisonebyanaturalisolateofNostocmuscorumJ.Phytochemistry,xx,65:2205-2209. MichleMaurs,RobertAzerad,ManuelCor