桑树WRKY转录因子的全基因组鉴定及生物信息学分析.doc

桑树WRKY转录因子的全基因组鉴定及生物信息学分析 摘要：目的明确桑树基因组中WRKY转录因子家族结构及其功能特征，为进一步揭示WRKY转录因子家族生物学功能提供科学依据。方法利用生物信息学方法对桑树WRKY转录因子的数目、类型、结构、系统进化关系、保守结构域和密码子使用偏性等进行全面分析。结果基于桑树全基因组蛋白数据库，共鉴定出55个桑树WRKY转录因子家族基因，占桑树基因总数（29261）的1.88%。桑树WRKY转录因子存在6种内含子数量类型及15种内含子相位类型，其中27个基因含有2个内含子，25个基因的相位类型为2-2型。保守结构域系统进化分析结果显示，桑树WRKY转录因子家族蛋白主要分为三大类（、和），I类可分为IN和Ic两个亚组，类根据聚类情况又可分为a、b、c、d和e等5个亚组。桑树WRKY转录因子蛋白保守结构域分析发现有五类Motif的保守性较强，桑树WRKY转录因子蛋白中均包含c端Motif1，I类蛋白同时含有N端Motif3。桑树WRKY转录因子家族基因启动子区富含PBF（C2H2锌指因子）和AHL（拟南芥hook因子）元件。密码子使用偏性分析结果显示，桑树WRKY转录因子家族基因的有效密码子数（ENC）介于48.00-60.00，密码子第3位GC含量（GC3s）介于0.330-0.722，平均亲水性值（Gravy）均为负值；同义密码子相对使用度（RSCU）I.000的密码子有29个，且以A（6个）或T（11个）结尾较G（4个）或c（8个）结尾的略多。结论桑树WRKY转录因子家族包含55个成员，内含子相位类型一致的同组成员可能同一祖先基因，且与基因复制和基因组重排有关；蛋白序列高度保守，在植物抵御环境胁迫过程中发挥作用；基因密码子使用偏性较弱，主要受碱基突变选择压力影响。 关键词：桑树；WRKY转录因子；密码子使用偏性；系统进化；生物信息学 0引言 研究意义WRKY转录因子家族是仅存于高等植物中的一类锌指蛋白，参与植物的生长发育，能对环境胁迫和病原侵染作出响应。首先，WRKY转录因子蛋白在植物免疫反应中发挥重要作用，是植物免疫系统各通路的中心组件，包括MTI、PTI、ETI、基本防御及系统获得抗性（Birkenbihletal.，xx）。其次，WRKY转录因子在植物的应激反应中也起关键作用，其网络涉及生物和非生物胁迫的各组成部分（Eulgem，xx；Zhuetal.，xx）。WRKY转录因子家族基因过表达能增強植物对盐和干旱胁迫的耐受性，同时增强抗病性（OiuandYu，xx）。此外，WRKY转录因子还在植物种子发芽、衰老及其他发育反应中发挥重要作用（Rushtoal.，xx；Verweijetal.，xx）。密码子使用偏性是指各种生物体偏爱使用三联密码子（编码相同氨基酸的同义密码子）的现象，普遍存在于生物界中，且物种的亲缘关系越近密码子使用偏性越相似；密码子使用偏性还与基因表达、蛋白质功能等密切相关。因此，研究密码子使用偏性对开展基因进化压力研究、基因表达水平预测及外源基因改良等均具有重要意义。前人研究进展WRKY转录因子家族含有60个高度保守的氨基酸WRKY功能域，包含N端的WRKYGQK保守的氨基酸和C端非典型的锌指结构（Rushtoal.，xx）。根据WRKY结构域数量和锌指结构氨基酸组成的不同，可将WRKY转录因子家族蛋白分为三大类：第1类含有2个WRKY结构域，具有Cys2-His2型（CX46CX22-23HX1H）锌指结构；第类和第类仅含有1个WRKY结构域，其中第类的锌指结构与第1类的类似，第类的锌指结构为Cys2-His-Cys型（CXvCXE3HTC），根据保守氨基酸残基的差异，第类又可分为5个亚类（Eulgemetal.，2000）。至今，已有多种植物WRKY转录因子家族基因被鉴定（Wuetal.，xx；Rossetal.，xx；Lingetal.，xx；HuangetaL，xx；DmgetaL，xx；Songetal，xx；Zhangetal.，xx），并证实WRKY转录因子家族参与植物的多种生理生化过程，包括衰老（zhangetal.，xx）、纤维发育（Dingetal.，xx）、生物和非生物胁迫（Songetal.，xx；Weietal.，xx）等。不同物种或同一物种不同基因问的密码子使用偏性不同，与基因在进化过程中所面对的选择压力不同有关。物种在进化过程中受基因突变压力和自然选择压力的双重影响，但由于二者在基因进化过程中所发挥作用的权重不同，导致密码子使用偏性具有物种特异性（赵洋等，xx；曲俊杰等，xx）。密码子使用偏性与GC含量有关时表示受突变压力影响（Cheal.，xx），与翻译过程有关时表示受正向选择压力影响（Sharpetal.，xx）。因此，通过优化密码子可提高外源基因在寄主细胞中的表达水平（周宗梁等，xx；Zelaskoetal.，xx）。本研究切入点桑树（Morusnotabilis）是一种常见的落叶乔木，其叶片是桑蚕的主要饲料，桑皮可用作造纸原料，桑果可供食用或酿酒，在我国多个省份均有栽培，但目前针对桑树WRKY转录因子基因及其蛋白的研究鲜见报道。拟解决的关键问题在桑树基因组测序工作的基础上，利用生物信息学方法全面预测分析桑树基因组中WRKY转录因子家族结构及其功能特征，为进一步揭示WRKY转录因子家族生物学功能提供科学依据。 1材料与方法 1.1蛋白序列获取与鉴定 桑树全基因组蛋白序列从GenBank数据库中搜索获得，以拟南芥WRKY转录因子蛋白序列为探针，在桑树全基因组蛋白数据库中进行BLASTp同源序列比对分析，通过NCBI在线工具CDD（s：/.ncbi.nlm.nih/cdd）和Pfam数据库（：/pfam.xfam/）进行蛋白结构域分析，并剔除无WRKY结构域的蛋白序列。 1.2基因及其蛋白结构分析 从NCBI中获得桑树WRKY转录因子基因序列和CDS序列，使用基因结构显示系统（：/gsds.cbi.pku./index.php）绘制基因结构示意图；通过MEMESUITE（：/meme-suite/tools/meme）預测桑树WRKY转录因子蛋白序列保守氨基酸Motif，参数设为默认值。 1.3基因启动子区特征分析 通过GenBank数据库获取桑树WRKY转录因子家族基因转录起始位点上游的2kb序列，以JASPAR（：/iaspar.genereg./）数据库分析启动子区富含转录调控基序。选择植物启动子基序数据库作为搜索数据库，相对阈值分数选择100%。 1.4蛋白系统进化分析 所有桑树WRKY家族蛋白通过Clustalx进行比对分析，选取WRKY和锌指结构域保守序列，采用MEGA5.0中的NJ（Neighbor-jioining）法构建系统发育进化树，参数选择Bootstrap为1000。系统发育进化树的绘制与优化使用Itol在线工具（：/itol.embl.de/）完成。 1.5基因密码子使用偏性分析 利用CodonW1.4.4对桑树WRKY转录因子家族基因CDS序列密码子的使用偏性进行分析，包括密码子适应指数（CAI）、有效密码子数（ENC）、密码子第3位GC含量（GC3s）和平均亲水性值（Gravy）等参数。以GC3s为横坐标、ENC为纵坐标绘制ENC-plot图谱。图谱中的曲线为ENC预期值，表示密码子使用偏性仅由碱基组成决定，计算公式为：ENC=2+GC3s+29/GC3s2+（1-GC3s）2。分布点越靠近标准曲线表示密码子使用偏性受碱基突变影响越大，越远离标准曲线表示密码子使用偏性受自然选择影响越大。使用EMBOSSexplorer网站（：/emboss.toulouse.inra.fr/）在线软件Cusp对同义密码子的相对使用度（Relativesynonymouscodonusage，RSCU）进行分析。 2结果与分析 2.1桑树WRKY转录因子家族成员鉴定及其序列分析结果 基于桑树全基因组蛋白数据库，经BLASTp同源搜索和SMART保守结构域鉴定，共获得55个桑树WRKV录因子基因（表1），占桑树基因总数（29261）的1.88%。其中，蛋白氨基酸残基数小于300aa的基因序列占24%，介于300-650aa的基因序列占71%，大于650aa的基因序列占5%。 桑树WRKY转录因子家族基因存在6种内含子数量类型（图1）。其中，有27个基因含有2个内含子，为数量最多的类型；有10个基因含有4个内含子；WRKY9基因的内含子数量达14个，为内含子数量最多的类型。桑树WRKY转录因子家族基因内含子相位类型有15种，呈多样性。其中，有25个基因的内含子相位为2-2型，是基因数量最多的类型；有6个基因的内含子相位为2型。进化组和进化组c中的基因内含子数量和相位类型较多样，说明组内基因较复杂；进化组a、进化组b、进化组d、进化组e和进化组中的基因结构和内含子相位类型高度一致，内含子相位为22型，可能是由同一祖先基因复制而来。 2.2桑树WRKY家族蛋白的系统进化分析结果 利用MEGA5.05对72个拟南芥WRKY转录因子蛋白和55个桑树WRKY转录因子蛋白的保守结构域序列进行系统进化分析，结果显示，桑树WRKY转录因子蛋白主要分为三大类（、和），其中，第类根据WRKY保守结构域处于N端或C端，可分为N和C两个亚组；第类根据聚类情况又可分为a、b、c、d和e等5个亚组（图2）。但MnWRKY49和MnWRKYlC未归入以上分组。 2.3桑树WRKY转录因子蛋白保守结构域分析结果 使用MEMESUITE对桑树WRKY转录因子保守氨基酸Motif进行分析，结果发现有五类Moti啪保守性较强，其正则表达式如图3所示。其中，Motif1是WRKYMotif，在桑树WRKY转录因子家族中高度保守；Motif3为进化组IN端的WRKY保守结构域；Motif2为锌指结构，仅MnWRKY28、MnWRKY43和MnWRKY54缺少该结构域。55个WRKY转录因子蛋白均具有Motif1，所有I类基因蛋白均具有Motif1和Motif3。Motif4为结构域，Motif5为LXsLXgLX3L基序，类似LRR结构域，进化组I、进化组a和进化组c的基因蛋白结构包含Motif4，进化组a、进化组b和进化组的基因蛋白结构包含Motif5。部分桑树WRKY转录因子保守结构域和锌指结构存在变异，如进化组c中MnWRKY50和MnWRKY51的保守结构域为WRKYGKK，MnWRKY28和MnWRKY54的锌指结构缺少CX.sCX22.23部分，进化组中MnWRKYl9和MnWRKY23的锌指结构分别为CX7CX23HRC和CX7CX23HIC，保守氨基酸残基发生变异。 2.4桑树WRKY转录因子家族基因启动子区特征分析结果 桑树WRKY转录因子家族基因启动子区均含有PBF结合元件（AAAGC），每个基因启动子平均含有4.8个元件（表2），PBF属于Dof家族C2H2锌指因子类，有助于bZIP转录因子结合DNA（Vicente-Carbaiosaetal.，1997）；另外两种C2H2锌指因子类（DOF2.4和DOF5.3）含量也较高。55个桑树WRKY转录因子家族基因中有28个基因的启动子区含有AHL20结合元件（AATTAAAT），AHLl2与AHL20转录因子均属于拟南芥hook因子，能特异性结合与核基质附着相关且富含AT的DNA序列，通过下调PAMP引发的NH01和FRKl可负调控植物对病原菌的先天性免疫作用（Luetal.，xx）。此外，部分桑树WRKY转录因子家族基因启动子区含有bZIP、ERF、GT-1、MYB、TGA和WRKY转录因子结合序列。 2.5桑树WRKY转录因子家族基因密码子使用偏性分析结果 为了解桑树WRKY转录因子家族基因密码子使用偏性，对ENC、GC3s和Gravy等参数进行分析，结果发现，桑树WRKY转录因子家族基因ENC介于48.00-60.00，GC3s介于0.330-0.722，Gravy均为负值（表3），表明桑树WRKY轉录因子蛋白均为亲水性蛋白，且多数具有强亲水性。 ENC与GC3s的关联分析结果显示，基因分布越靠近ENC-plot图谱标准曲线表示密码子使用受碱基突变压力影响越大，基因分布在标准曲线下方或远离曲线，表示基因受自然选择压力影响越大。GC3s分布则反映植物所受的选择压力，GC3s分布越广泛，表明密码子使用偏性受碱基突变压力越大，GC3s分布范围越小，表明密码子使用偏性受正向选择压力影响越大（KawabeandMivashita，xx）。由图4可知，桑树WRKY转录因子家族基因的GC3s介于0.330-0.722，分布较广泛，且多数基因ENC分布在标准曲线下方，表明桑树WRKY转录因子家族基因同时受到碱基突变和正向选择压力的影响。 RSCU是同义密码子实际使用量与理论使用量的比值。RSCU1.000，表示密码子使用频率高于其他同义密码子；反之则使用频率低。由表4可知，RSCUI.000的密码子有29个，且以A（6个）或T（11个）结尾较G（4个）或C（8个）结尾的略多，说明桑树WRKY转录因子家族基因的密码子使用偏性较弱，略偏好A或T结尾。 3讨论 WRKY转录因子蛋白为植物特有转录因子家族，广泛参与植物多种生物学进程的调控。至今，多个已完成基因组测序植物的WRKY转录因子家族基因被鉴定，番茄基因组中有81个WRKY转录因子家族基因（Wuetal.，xx），黄瓜有55个WRKY转录因子家族基因（Rossetal.，xx），大豆有176个WRKY转录因子家族基因（Lingetal.，xx），棉花有113个WRKY转录因子家族基因（Huangetal.，xx），粳稻有98个WRKY转录因子基因（周宗梁等，xx），拟南芥有72个WRKY转录因子家族基因（Zelaskoetal.，xx），苹果有132个WRKY家族基因（谷彦冰等，xx）。Baranwal等（xx）研究发现，桑树基因组中含有54个WRKY转录因子基因。同一家族基因的数量与植物进化过程中基因复制、基因组重排等有关，如水稻、番茄、苹果和棉花的WRKY转录因子家族均存在基因复制现象（Wuetal.，xx；Huangetal.，xx；周宗梁等，xx），但在WRKY转录因子数量较少的黄瓜中未发现基因复制现象（Rossetal.，xx）。WRKY转录因子基因数目除了与物种基因组有关外，还与植物进化过程中所受的环境压力有关。本研究结果显示，桑树WRKY转录因子家族基因数量为55个，属于WRKY转录因子家族基因相对较少的物种类型，说明进化过程中该家族基因受到的环境压力较小。 基因结构中内含子数量及相位类型是研究基因进化的重要证据。根据剪接中位置的不同，内含子分为3种相位类型，0型内含子位于2个密码子之间，1型内含子位于密码子的第1和第2碱基之间，2型内含子位于密码子的第2和第3碱基之间（Sharp，1981）。内含子相位的改变会导致后续阅读框发生变化，因此内含子的相位通常比较保守。本研究中，桑树WRKY家族蛋白主要分为三大类（、和），且有2个蛋白（MnWRKY49和MnWRKYlC）未进行分组，与Baranwal等（xx）将桑树WRKY转录因子家族分为四类的研究结果基本一致。本研究还发现，同一进化组的基因结构内含子数量和相位类型高度一致，进化组a和进化组b的内含子相位类型全部为0型，进化组d、进化组e和进化组全部为2型。约50%桑树WRKY转录因子家族基因包含2个内含子，其中有25个基因的内含子相位为2-2型，分别属于进化组c、进化组d、进化组e和进化组，推测其共同的祖先基因。 本研究的系统进化分析结果显示，桑树WRKY家族蛋白主要分为三大类，类又分为5个亚组。所有成员均含有保守基序WRKYGQK（MnWRKY50和MnWRKY51为WRKYGKK外），类和类还包含有保守的锌指结构C2H2（除MnWRKY28和Mn-WRKY54缺少外），类的锌指结构为C2HC。Rinerson等（xx）研究认为，植物中WRKY转录因子家族基因存在两种可能的起源方式，一种起源于类蛋白C端WRKY结构域，一种起源于藻类a或b的某一蛋白结构域。桑树WRKY转录因子蛋白保守结构域分析发现有五类Motif的保守性较强，所有桑树WRKY蛋白中均包含C端Motif1，类蛋白同时含有N端Motif3。进化组a、进化组b和进化组中含有类似LRR结构域的Motif5。可见，植物WRKY转录因子基因家族结构上高度保守，桑树WRKY转录因子可能起源于I类基因蛋白C端WRKY结构域。 WRKY蛋白特异性结合DNA的最小基序TTGAC（C/T）称作W-box。多数WRKY转录因子的目标基因启动子中均含有数量不定的W-box，彼此间或同向排列或形成回文结构，WRKY转录因子与其结合，而调节下游功能基因或其他转录因子的表达（Eulgemetal.，2000）。一些植物WRKY转录因子家族基因启动子中也存在W-box，如拟南芥WRKYl8启动子中的W-box是起负调控作用的顺式作用元件，能阻止拟南芥WRKYl8在抗病期间的过量表达，从而缓解该基因对植物生长造成的