姜黄素对人结肠癌Lovo细胞VEGF表达的影响.doc

姜黄素对人结肠癌Lovo细胞VEGF表达的影响 袁琦张征胡小宣 湖南省人民医院肝病内科，湖南长沙410005 摘要目的研究姜黄素体外对人结肠癌Lovo细胞血管内皮生长因子VEGF表达的影响。方法不同浓度（0mol/L、5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L）姜黄素处理xx年8月xx年2月中南大学提供的人结肠癌细胞株Lovo24h后，用Real-timePCR检测姜黄素对人结肠癌细胞株血管内皮生长因子VEGFmRNA表达的变化，用Westernblot法检测姜黄素对人结肠癌细胞株VEGF蛋白表达的变化。结果人结肠癌Lovo细胞经过姜黄素处理24h后，5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L姜黄素组VEGFmRNA及蛋白的表达均明显下降，与对照组比较差异有统计学意义（P0.05）。结论姜黄素能下调人结肠癌Lovo细胞VEGF的表达，并呈剂量依赖，这可能是姜黄素抑制结肠癌Lovo细胞增殖及侵袭性的机制之一。 关键词姜黄素；结肠癌；血管内皮生长因子 R587.1A1674-074（4）12（b）035-03 作者简介袁琦（1983.1-），女，湖南邵东人，医学硕士，医师，研究方向：消化道肿瘤。 姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的一种天然有效成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种药理作用，且毒性低，具有良好的临床应用潜力，尤其是其抗肿瘤作用受到国内外广泛关注。结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，虽然近年来以手术、化疗、放疗、免疫等的综合治疗手段取得了一定的进展，但其死亡率仍居高不下，毒性作用依然限制着化疗药物和免疫制剂等的应用和疗效。有研究表明，姜黄素能显著抑制结肠癌HCT-116细胞的生长1，姜黄素能显著抑制人结肠癌Lovo细胞的增殖并促进其凋亡2，研究证实在肿瘤的侵袭、转移过程中，血管内皮生长因子（VEGF）起到了极其重要的作用3。该实验以xx年8月xx年2月中南大学提供的结肠癌Lovo细胞作为研究对象，观察了不同浓度姜黄素对结肠癌Lovo细胞VEGF表达的影响，以求从多角度对姜黄素对结肠癌细胞的作用进行研究，对结肠癌临床治疗提供有益的理论依据，现报道如下。 1资料与方法 1.1一般资料 人结肠癌Lovo细胞由中南大学肿瘤研究所提供；姜黄素购自Sigma公司，称取3.684mg的原料药充分溶解于1mLDMSO中，得到终浓度为10mmol/L的母液，临用时用完全细胞培养液稀释到所需浓度。Trizol、逆转录试剂盒购自大连宝生物公司，引物由大连宝生物公司合成。蛋白提取液及ECL发光试剂盒购自Pierce公司，兔抗人VEGF多克隆抗体及羊抗兔二抗lgG购自SantaCruz公司。 1.2细胞的培养及处理 人结肠癌Lovo细胞接种于含10%胎牛血清1640培养基，置于37、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，隔天换液，待细胞长至对数生长期时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的Lovo细胞，实验分组为对照组（姜黄素0mol/L，加入等量DMSO），姜黄素5mol/L，10mol/L，20mol/L，40mol/L组，处理后再置于37、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养24h。 1.3Real-timePCR 采用Trizo1试剂一步法提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，计算OD260/280，比值在1.82.0的RNA标本用于反转录。总RNA按说明书进行逆转录反应合成cDNA，逆转录产物cDNA用于Real-time-PCR扩增。VEGF引物：5端：5-GGGGGATCCGCCTCCGAA-ACCATGAACTT-3及3端：5-CCCGAATTCTCCTGGTGAGAGA-TCTGGTT-3，变性、退火温度为94与72，40个循环。利用标准曲线，根据样品CT值计算出样品中所含的模板量。 1.4WesternBlot 用蛋白提取液提取细胞蛋白，BCA测总蛋白质浓度。蛋白样品用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，上样量为20g。5%脱脂奶粉TBS缓冲液封闭，4过夜，加兔抗人VEGF多克隆抗体（1：500）室温2h，洗膜30min，加入羊抗兔二抗（1：1000）室温结合1h，ECL显色，内参采用-actin。采用Image-ProPlus6.0图像分析软件对蛋白条带进