GB-T19438.2-2004H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法.pdf

I C S 1 1 . 2 2 0一一B药黔中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 G B / T 1 9 4 3 8 . 2 -2 0 0 4H 5 亚型禽流感病毒荧光R T P C R检测方法 Me t h o d o f t h e r e a l - t i me RT - P CR f o r t h e d e t e c t i o n o f a v i a n i n f l u e n z a v i r u s s u b t y p e H 52 0 0 4 - 0 2 - 1 4发布2 0 0 4 - 0 2 - 1 5实施 率 替冒 瞥 臀 瓣 瞥篷 臀臀暴 发 “免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 1 9 4 3 8 . 2 -2 0 0 4 前言 G B / T 1 9 4 3 8 -2 0 0 4 禽流感病毒荧光R T - P C R检测方法 分为以下四个部分： G B / T 1 9 4 3 8 . 1 -2 0 0 4 禽流感病毒通用荧光 R T - P C R检测方法 ； G B / T 1 9 4 3 8 . 2 -2 0 0 4 ( H 5 亚型禽流感病毒荧光R T - P C R检测方法 ； G B / T 1 9 4 3 8 . 3 -2 0 0 4 t( H 7 亚型禽流感病毒荧光R T - P C R检测方法 ； G B / T 1 9 4 3 8 . 4 -2 0 0 4 ( H 9 亚型禽流感病毒荧光R T - P C R检测方法 。 本部分的附录 A是资料性附录。 本部分 由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。 本部分起草单位 ： 中华人民共和国北京出人境检验检疫局 、 深圳市匹基生物工程股份有限公司。 本部分主要起草人 ： 刘环 、 张鹤晓、 赖平安、 周琦、 刘宁。免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 G B / T 1 9 4 3 8 . 2 -2 0 0 4 H 5 亚型禽流感病毒荧光R T - P C R检测方法1 范围 本部分规定 了 H 5 亚型禽流感病毒荧光 R T - P C R操作方法。 本部分适用于活禽及其产品中H5 亚型禽流感病毒的检测。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件， 其随后所有的修改单（ 不包括勘误的内容） 或修订版均不适用于本部分， 然而， 鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 。凡是不注 日 期 的引用文件 ， 其最新版本适用于本部分 。 G B / T 1 9 4 3 8 . 1 -2 0 0 4 禽流感病毒通用荧光R T - P C R检测方法3 缩略语 下列缩略语适用于本部分。3 . 1 荧光 R T - P C R 荧光反转录一 聚合酶链反应。3 . 2 C t 值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阂值时所经历的循环数。3 . 3 RNA 核糖核酸。3 . 4 T a q 酶 T a q D N A聚合酶。3 . 5 PBS 磷酸盐缓冲生理盐水。3 . 6 DEP C 焦碳酸乙二醋 。4 原理 采用 T a g Ma n 方法， 在比对禽流感病毒血凝素基因的基础上， 设计一对仅在 H5 亚型禽流感病毒血凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。该探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其中5 端标记F A M荧光素为报告荧光基团（ 用R表示） , 3 端标记T A MR A荧光素为淬灭荧光基团（ 用Q表示） ， 它在近距离内能吸收5 端荧光基团发出的荧光信号。反应进人退火阶段时， 引物和探针同时与目的 基因片段结合， 此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团 所吸收， 仪器检测不到荧光信号； 而反应进行到延伸阶段时， T a q 酶发挥5 -3 的外切核酸酶功能， 将探针降解。这样探针上的免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 1 9 4 3 8 . 2 -2 0 0 4R基团游离出来， 所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着P C R反应的循环往复， P C R产物呈指数形式增长， 荧光信号也相应增长， 实现了荧光信号的累积与P C R产物形成完全同步。5 试荆和材料5 . 1 试剂 除另有说明， 所用试剂均为分析纯； 所有试剂均用无R N A酶的容器（ 用D E P C水处理后高压灭菌）分装。5 . 1 . 1 三氯 甲烷。5 . 1 . 2 异丙醇： 一2 0 预冷。5 . 1 . 3 7 5 乙醇： 用新开启的无水乙醇和D E P C水配制， -2 0 0C预冷。5 . 1 . 4 0 . 0 1 m o l / L ( p H 7 . 2 ） 的P B S ： 配方见G B / T 1 9 4 3 8 . 1 -2 0 0 4中附录A, 1 2 1 C士2 C , 1 5 m i n 高压灭菌冷却后， 无菌条件下加人青霉素、 链霉素各1 0 0 0 0 I U / mL ,5 . 1 . 5 H5 亚型禽流感病毒荧光R T - P C R检测试剂盒1 ) ： 试剂盒的组成、 说明及使用注意事项参见附录 A,5 . 2 仪器设备5 . 2 . 1 高速台式冷冻离心机： 最大离心力 1 2 0 0 0 r / mi n 以上。5 . 2 . 2 荧光P C R检测仪、 计算机。5 . 2 . 3 2 C -4 冰箱和一2 0 冰箱。5 . 2 . 4 微量加样器： 0 . 5 p L -1 0 p L , 5 p L -2 0 IA L , 2 0 p l , -2 0 0 f A L , 2 0 0 ti L - 1 0 0 0 p L a5 . 2 . 5 组织匀浆器。5 . 2 . 6 混匀器。5 . 2 . 7 可移动紫外灯。6 样品的采集与前处理 采样过程中样本不得交叉污染， 采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。6 . 1 取样工具 下列取样工具必须经1 2 1 士2 0C, 1 5 m i n 高压灭菌或经1 6 0 士2 干烤2 h , 拭子 ； 剪、 镊 ； 研钵 ； E p p e n d o r f 管( 1 . 5 mL ) 。6 . 2 采样方法6 . 2 . 1 活禽样品 取咽喉拭子和泄殖腔拭子， 具体采集方法如下： 咽喉拭子， 采取时要将拭子深人喉头及上愕裂来回刮 3 次5 次， 取咽喉分泌液 ； 取泄殖腔拭子时， 将拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便； 将咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放人盛有 1 . 0 mL P B S的E p p e n d o r f 管中， 编号备用。6 . 2 . 2 内脏或肌肉样品 用无菌摄剪夹取待检样品2 . 0 g 于研钵中充分研磨， 再加 1 0 mL P B S混匀， 或置于组织匀浆器中，加人1 0 m L P B S 匀浆， 然后将组织悬液转人无菌E p p e n d o r f 管中3 0 0 0 r / m i n 离心1 0 mi n ， 取上清液转 1 ）由指定单位提供， 给出这一信息是为了方便本标准的使用者， 并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具 有相同的效果， 则可使用这些等效产品。免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 G B / T 1 9 4 3 8 .2 =2 0 0 4人E p p e n d o r f 管中， 编号备用。6 . 2 . 3 血清或血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌E p p e n d o r f 管中， 编号备用。6 . 3 存放与运送 采集或处理的样本在2 0C -8 条件下保存应不超过2 4 h ； 若需长期保存， 须放置一7 0 冰箱， 但应避免反复冻融（ 最多冻融三次） 。采集的样品密封后 ， 采用保 温壶或保温桶加冰密封 ， 尽快运送 到实验室 。7 操作方法7 . 1 实验室的设！与管理 实验室的设置与管理见G B / T 1 9 4 3 8 . 1 -2 0 0 4中附录C ,7 . 2 样本的处理 在样本处理区进行 。7 . 2 . 1取n 个1 . 5 m L灭菌E p p e n d o r f 管， 其中n 为待检样品数、 一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号。7 . 2 . 2 每管加人6 0 0 f A L裂解液， 然后分别加入待测样本、 阴性对照、 阳性对照各2 0 0 p L ， 吸头反复吸打混匀（ 一份样本换用一个吸头） ； 再加人2 0 0 u L三氯甲烷， 混匀器上震荡混匀5 s （ 不宜过于强烈， 以免产生乳化层， 也可用手颠倒混匀） 。于4 条件下， 1 2 0 0 0 r / m i n 离心1 5 min ,7 . 2 . 3 取与7 . 2 . 1中相同数量的1 . 5 mL灭菌E p p e n d o r f 管， 加人4 0 0 u L异丙醇（ 一2 0 r预冷） ， 对每个管进行编号。吸取 7 . 2 . 2 离心后各管中的上清液转移至相应的管中， 上清液至少吸取5 0 0 p L ， 注意不要吸出中间层 ， 颠倒混匀。7 . 2 . 4 1 2 0 0 0 r / m i n 离心1 5 m i n ( E p p e n d o r f 管开口 保持朝离心机转轴方向放置） 。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上， 沾干液体， 不同样品应在吸水纸不同地方沽干。加人6 0 0 u L 7 5 乙醇， 颠倒洗涤。7 . 2 . 5 于4 条件T, 1 2 0 0 0 r / m in 离心1 0 m i n ( E p p e n d o r f 管开口 保持朝离心机转轴方向放置） 。轻轻倒去上清液， 倒置于吸水纸上， 沽干液体， 不同样品应在吸水纸不同地方沾干。7 . 2 . 6 4 0 0 0 r / m in 离心1 0 s ( E p p e n d o r f 管开口 保持朝离心机转轴方向放置） ， 将管壁上的残余液体甩到管底部， 用微量加样器尽量将其吸干 ， 一份样本换用一个吸头 ， 吸头不要碰到有沉淀一面， 室温干燥3 m in 。 不宜过于干燥 ， 以免 R N A不溶 。7 . 2 . 7 加人1 1 u L D E P C 水， 轻轻混匀， 溶解管壁上的R N A , 2 0 0 0 r / m i n 离心5 s ， 冰上保存备用。提取的R N A须在2h 内进行R T - P C R扩增或放置于一7 0 冰箱。7 . 3 扩增试剂准备与配It 在反应混合物配制 区进行 。 从试剂盒中取出A I V H5 亚型R T - P C R反应液、 T a q 酶， 在室温下融化后， 2 0 0 0 r / m i n 离心5 s o设所需 P C R数为 n ， 其 中 n 为待检样品数 、 一管 阳性对照及一管阴性对照之和 ， 每个样本测试反应体系配制见表 1 , 表 1 测试反应体系配制表卜 一 y tJ 一 RT-PCR bZ T-2 A /uL15一 Taq /pL0.25 一 计算好各试剂的使用量， 加人一适当体积试管中， 向其中加人0 . 2 5 Xn 颗R T - P C R酶颗粒， 充分混合均匀， 向每个P C R管中各分装1 5 u L ， 转移至样本处理区。7 . 4 加样 在样本处理区进行。在各设定的P C R管中分别加人 7 . 2 . 7中制备的R N A溶液各 1 0 I .L ， 盖紧管免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 1 9 4 3 8 . 2 -2 0 0 4盖后 ， 5 0 0 r / m i n 离心 3 0 s .7 . 5 荧光 R T - P C R反应 在检测区进行 。将 7 . 4中加样后的 P C R管放人荧光 P C R检测仪内， 记录样本摆放顺序。 循环条件设置： 荧光R T - P C R检测 H 5 亚型禽流感病毒的反应参数为： 第一阶段， 反转录4 2 0C / 3 0 m i n ; 第二阶段， 预变性9 2 0C / 3 m i n ; 第三阶段 ， 9 2 0 C / 1 0 s , 4 5 0C / 3 0 s , 7 2 C/ 1 m i n , 5 个循环 ； 第四阶段， 9 2 0C/ 1 0 s , 6 0 0C / 3 0 s , 4 0 个循环， 荧光收集设置在第四阶段每次循环的退火延伸时 进行 。8 结果判定8 . 1 结果分析条件设定 读取检测结果。闽值设定原则以阔值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点 ， 结果显示阴性为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。8 . 2 质控标准8 . 2 . 1 阴性对照无C t 值并且无扩增曲线。8 . 2 . 2 阳性对照的C t 值应小于2 8 . 0 ， 并出现典型的扩增曲线。否则， 此次实验视为无效。8 . 3 结果描述及判定8 . 3 . 1 阴性 无C t 值并且无扩增曲线， 表示样品中无H 5 亚型禽流感病毒。8 . 3 . 2 阳性 C t 值小于等于3 0 . 0 ， 且出现典型的扩增曲线， 表示样本中存在H5 亚型禽流感病毒。8 . 3 . 3 有效原则 C t 值大于 3 0 . 0的样本须重做。重做结果无 C t 值者为阴性， 否则为阳性。免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 G B / T 1 9 4 3 8 . 2 -2 0 0 4 附录A （ 资料性附录） H 5 亚型禽流感病毒荧光 R T - P C R试剂盒组成 、 说明及使用时的