布鲁氏菌病原学、血清学诊断.ppt

布鲁氏菌病原学、血清学诊断,丽水市疾病预防控制中心 兰进权,主要内容：,1、布鲁氏菌病原学； 2、布鲁氏菌诊断标准； 3、布鲁氏菌血清学实验的几种方法。,（一）布氏菌概述,1887年英国医生布鲁氏首先从死于“马尔他热”的英国士兵脾脏中分离出羊种布氏菌后，布鲁氏菌属（Brucella)，包括6个种19个生物型。 羊种布氏菌（Br melitensis) 牛种布氏菌（Br abortus) 猪种布氏菌（Br suis) 沙漠森林野鼠种布氏菌（Br neotomae) 绵羊附睾种布氏菌（Br ovis) 犬种布氏菌（Br canis) ,布鲁氏菌的发展史,（一）病原学概述,布鲁氏菌属（Brucella) 包括6个种19个生物型。 牛种布氏菌（Br abortus) ： 1、2、3、4、5、6、7、9型 羊种布氏菌（Br melitensis) ：1、2、3型 猪种布氏菌（Br suis) ： 1、2、3、4、5型 沙漠森林野鼠种布氏菌（Br neotomae) 绵羊附睾种布氏菌（Br ovis) 犬种布氏菌 （Br canis),1、形 态,布鲁氏菌是一组微小的球状、球杆状、短杆状细菌； 宽约0.30.5微米、长0.61.5微米。电镜下见到的羊种菌为明显的球杆状、牛种菌和猪种菌为短杆状； 6种布鲁氏菌靠形态很难区分，一般来说，羊种菌最小，牛种菌产次之，猪种菌较大； 布鲁氏菌没有鞭毛，不形成芽胞和夹膜。,2、染 色,涂片染色检查多为单个排列，少见成对短链排列。 布鲁氏菌可被碱性染料着色； 革兰染色阴性； 柯兹罗夫斯基提出用0.5%沙黄水溶液染色，加热出现气泡，水洗后用0.5%孔雀绿或1%美兰复染，布鲁氏菌呈红色，其它细菌呈绿色和兰色。,布鲁氏菌：,革兰阴性， 长约0.6-1.5m, 宽约0.3-0.6m, 用柯氏染色染成红色,无鞭毛、不形成芽胞和荚膜。,3、培养特性,1.布鲁氏菌培养营养要求高： 需要各种氨基酸和各种金属离子，有的菌种需要血清才能生长。 2.生长缓慢：一般需经46天，有的甚至2130天才能长出菌落。 3.生长所需温度：2040，最适为37,超过42则不生长。 4. C02: 绵羊附睾种菌和牛种菌的某些生物型菌需严格的C02(510)。,（4） 细菌变异,布氏菌在各种理化因素作用下易发生变异; 即从光滑型（S）变为非光滑型粗糙(R)或粘液(M)状。 变异菌落常比光滑型稍长，表面有颗粒。菌落颜色为灰白色或褐色，,（5） 抵抗力,布氏菌在合适条件下能生存很长时间，有较高的抗灭活能力。 对湿热、紫外线和各种射线以及常用的消毒剂、抗生素、化学药物比较敏感； 对低温和干燥有较强的抵抗力，故可用冷冻真空干燥法保存菌种。,布氏菌在自然条件下的生存能力,(1)对物理因子的抵抗力,物理因子对布氏菌的影响 物理因子 生存时间 物理因子 生存时间 湿热56 60分钟以上 干热80 60分钟以上 湿热63 60分钟以上 干热90 60分钟以上 湿热80 30分钟以上 干热100 7分钟以上 湿热90 10分钟以上 直射阳光 14小时 湿热100 半分钟死亡 散射阳光 78天 ,(2)对化学因子的抵抗力,化学因子对布氏菌的影响 药物名称 浓度(%) 生存时间 药物名称 浓度(%) 生存时间 新洁尔灭 0.1 30秒钟 漂白粉 0.22.5 2分钟以内 石炭酸 12 15分钟 红 汞 2 7分钟 来苏儿 2 13分钟 过锰酸钾 0.10.2 715分钟 来苏儿 3 1分钟以内 甲 醛 0.2 20分钟以上 氯亚明 0.2 57分钟 乳 酸 0.5 1分钟以内 氯亚明 0.5 35分钟 氢氧化钾 2 3分钟 升 汞 0.05 1分钟以内 肥皂 2 20分钟以上 ,主要化学药品对三型菌的影响, 浓度 布鲁氏菌生存时间(分钟) 化学药品名称 (%) 羊型 牛型 猪型 石 碳 酸 1 5 3 5 石 碳 酸 2 1 2 1 来 苏 儿 2 3 1 3 来 苏 儿 3 瞬间 瞬间 瞬间 漂白粉澄清液 0.2 1-2 瞬间 瞬间 漂白粉乳剂 2.5 1-2 瞬间 瞬间 肥 皂 水 2 20 20 20 ,（二）布鲁氏菌分离培养,采用何种方法、 取何种材料、 何种培养基 实验室条件,布氏菌的分离培养,一、从可疑病人分离布氏菌 血培养： 30天未培养出菌，可定位阴性 。 骨髓培养：抽取骨髓（接种双相培养基） 尿培养： 其他病原材料培养:乳、脑脊液、关节液和滑囊液分离布氏菌，参照血培养观察结果，15天不长菌定为阴性,二、从牲畜材料中分离布氏菌 从牲畜流产羔检菌： 从胎衣检菌： 从阴道分泌物检菌： 尿液检菌： 乳汁检菌： 脓汁检菌： 血液培养： 脏器检菌：,我国出菌宿主及材料,我国从人、羊、牛、猪、犬、鹿、马、骆驼等家畜及黄羊、岩羊、黄鼠、黄胸鼠等野生动物检出布氏菌。从牧区水塘水和羊毛中也检出过布氏菌。 出菌材料有血液、关节液、滑囊液、骨髓、脑髓液、胸液、淋巴结、乳汁、脓汁、胆汁、尿、阴道分泌物、等20余种。 由于取材难易等原因，人多由血液、关节液、滑囊液、骨髓出菌；羊多由流产羔、胎盘、死羔检出菌；牛多由流产犊、乳汁检出菌；猪多由流产仔猪、胎盘出菌。,布氏菌的鉴定及分型, (一)常规确定布氏菌属细菌的方法 菌落生长时间和形态; 菌体形态和染色; 布氏菌血清凝集试验; (二)特殊方法： 1细菌DNA鸟嘌呤十胞嘧啶克分子百分比(C+CMOL)的测定; 2布氏菌DNA与可疑菌DNA杂交试验; 3应用色谱技术鉴定布氏菌;,布氏菌属的种、型鉴定方法,初代分离培养对二氧化碳的需要 硫化氢产生试验 染料抑菌试验 单项特异性血清A、M、R凝集试验 粗糙型（R型）血清凝集试验（玻片、试管法） 噬菌体裂解试验 尿素酶活性试验,布鲁氏菌分离用培养基,血清葡萄糖琼脂培养基 胰酶大豆培养基 土豆琼脂培养基 胰示琼脂 Albimi琼脂培养基 肝琼脂培养基 土豆+10%马血清培养基 效果最好,SAT滴度与培养阳性的符合率,BSL2：实验室设施 (二级屏障),人间布病诊断方法和判定标准,1、流行病学接触史： 密切接触家畜、野生动物、畜产品、 布鲁氏菌培养物等或生活在疫区内的居民。 2、临床症状和体征:应排除其他疑似疾病。 3、实验检查：病原分离 试管凝集试验 补体结合试验 抗人球蛋白试验 参考：（皮内变态反应试验、虎红平板凝集试验）,人间布病血清学阳性判定标准,病原分离:检出布鲁氏菌； 试管凝集试验:1:100(+)及以上为阳性； 补体结合试验:1:10 (+)及以上为阳性； 抗人球蛋白试:1:400(+)及以上为阳性；,人间布病诊断方法和判定标准,凡具备1、2和第3项中的任何一项检查阳性即可确定为布病病人。 对已确诊的慢性布病病人和接种过菌苗的人，应以临床症状为主要依据，血清学试验效价高低，皮变反应仅供参考。,(1）布氏菌素皮内变态反应试验,原理：当机体受布氏菌抗原作用之后，导致T细胞过敏。致敏T细胞再遇到相同抗原后进行分化，衍变，产生能释放各种淋巴因子的效应细胞，局部的皮肤变态反应就是各种淋巴因子综合作用的结果，是一种迟发型变态反应。 注意： 布氏菌素注射后，不会使人感染布病；也不会导致常规检测的抗体增加。 器材及试剂： 布氏菌素、酒精棉球，1ml注射器，测量尺,皮内变态反应操作方法,1.每次注射前必须详细询问职业、健康情况曾否接种过布氏菌活菌苗等。 2.前臂掌侧中部皮肤用75%酒精棉球消毒，待干后，用1ml注射器皮内注射0.1ml。 3.判定反应时间：注射后24、48h各观察一次（以48H结果为准）。 4.判定反应标准：阳性反应局部红肿达2x2cm或面积4cm2,皮内变态反应注意事项,部位：要皮内注射，切勿皮下注射 剂量：为0.1ml，注射后应在注射部位有小白泡隆起，注射液不得从针口漏出。 消毒：用酒精，切勿用碘酒，以免引起假阳性反应。 面积计算：浸润、伪足都属于测量范围 制品浑浊，有摇不散的沉淀，有异物，安瓶有裂纹，标签不清，过期失效者不可使用。 保存：布氏菌素于4-10冷暗处.,皮内变态反应禁忌,既往有各种过敏史者， 支气管哮喘病者 不可使用,评价：,此法敏感性较好，呈阳性反应的人只表示受过布氏菌感染，不能做最后判定。 此法用于流行病学调查和大量检疫，所以布病监测时为初诊方法，若皮变阳性，应采血进一步做特异性抗体检测。,（2）试管凝集试验,原理： Ag+Ab Ag-Ab,Nacl电介质,布氏菌侵入机体后，就会刺激机体产生特异性抗体，这种抗体可与相应抗原（布氏菌体）发生特异性结合，在电介质作用下，就会形成肉眼可见的凝集反应，我们就是用已知抗原查未知抗体。,试管凝集反应步骤,0.5,0.5,0.5,0.5,试管凝集反应（SAT）示意图(1),0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,稀释血清,1:25,1:50,1:100,1:200,1:400,稀释度,比浊管的制备,每次试验须作三种对照,阴性血清对照 阳性血清对照 抗原对照,结果判定： 根据各管中上层液体的清亮度记录凝集反应程度（滴度），特别是50%清亮度（+）对判定结果关系较大，一定要与比浊管对比判定。 + 等于完全凝集，上层液100%清亮。 + 等于几乎完全凝集，上层液75%清亮。 + 等于显著凝集，上层液50%清亮。 + 等于有凝集出现，液体25%清亮。 - 等于无凝集，液体不清亮。 人的诊断标准：1:100+为阳性，1:50+为可疑。,评价：试管凝集试验是Wright和Sample于1898年首先建立的，是布病诊断在国际上唯一的全标化方法，使用广泛，经久不衰。特异性好，也较敏感，实用性强，诊断、流调、监测均适用。 缺点： 有前带现象。 不能区别人工免疫和自然感染。 产生一定的交叉反应。 慢，需要两天。,（3）、虎红平板凝集试验,(一)器材及试剂 清洁脱脂玻片或有凹型孔的玻片，0.1毫升吸管或微量加样器、牙签或细铁丝。虎红平板凝集抗原、被检血清。 (二)操作方法 在玻片上加0.03毫升被检血清，然后加入虎红平板抗原0.03毫升，摇匀或用牙签混匀，在5分钟内判定结果。判定级别同平板凝集反应。亦可只分为(+)阳性，(-)阴性两类。 ,评价,简便、快速易行，具有较好的特异性， 有一定的敏感性，检查牛的阳性率稍 高于绵山羊。 该法可用于大面积检疫。,（4）、补体结合试验(CFT),原理 受检系统 指示系统 溶血反应 补体结合试验 1.仅有抗体,抗体,补体,红细胞,溶血素,阳性,阴性,2.仅有抗原,抗原,红细胞,溶血素,补体,阳性,阴性,3.抗原抗体反应,抗原,抗体,补体,红细胞,溶血素,阴性,阳性,补体结合试验（CFT）补体滴定须做对照,结果 抗原对照 （加抗原不加补体） 补体对照 （加补体不加抗原） 溶血素对照（加溶血素和绵羊红细胞） ,优点： 补体结合试验是一种传统的免疫学技术，特异性强。它所查的免疫蛋白主要是IgG类，此法不仅与布病临床表现、病期有较好一致性，常用于鉴别诊断。 缺点：参与反应的成分多， 影响因素复杂，操作 烦琐，不适与普查。,斑点金标免疫渗滤法