细胞凋亡检测实验（多种合集）.pdf

解螺旋 陪伴医生科研成长 1 细胞凋亡细胞凋亡检测实验检测实验 1.1. 实验原理实验原理 在凋亡的发生过程中， 细胞表现出非常明显的形态学特征。 这些形态学特征主要有以下 几点：1）细胞丧失了表面结构，形成光滑的轮廓，从周围的正常细胞组织中分离了出来。 2）细胞体积变小。在细胞体积变小的过程中，主要的形态学变化有：胞浆内细胞器发生集 中分布；细胞膜出芽/起泡（bleb） ，细胞发生皱缩。但是在细胞体积变小的过程中，细胞胞 浆内的细胞器形态始终保持完整性。3）细胞核内染色质结构改变。这是整个过程中形态学 上最引人注意的形态变化。 染色质的形态学变化主要表现为： a） 染色质固缩 （condensation） ； b）染色质边缘化（margination） ；c）细胞核内胞浆紧实（compaction） ；d）细胞核的核膜 折叠（fold） 。4）细胞形成凋亡小体（Apoptotic body） 。在这一阶段，凋亡细胞会裂解为 很多由细胞膜包饶的小体。 在每一个凋亡小体内都有一簇细胞器。 由于细胞器被细胞膜包饶， 没有细胞内容物的外泄，因此不会引起周围的炎症反应。5）凋亡细胞/凋亡小体被识别和被 吞噬。凋亡小体会被迅速吞噬，形成吞噬体（phagosome） ，随后这些吞噬体进一步变性，成 为溶酶体残留小体（lysosomal residual body） 。解螺旋 2.2. 实验目的实验目的 检测细胞的凋亡情况 1）研究体系中是否有凋亡现象发生， （定性） ； 2）凋亡的发生率。 （相对的概念，很多时候需要结合细胞群体的增殖率来分析） ，反映细胞 群体的生长状态； 3）了解细胞凋亡的严重程度以及凋亡的发生阶段。 3.3. 实验实验材料材料 3.1.3.1. 主要试剂主要试剂（以以 western blotwestern blot 试剂试剂为主，实验室常规试剂略去不计为主，实验室常规试剂略去不计） 试剂试剂 来源来源 Cat.No.Cat.No. 解螺旋 陪伴医生科研成长 2 RIPA 碧云天 P0013C PMSF Bio-Rad MSB1001 Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 4X Leammli 加样缓冲液 Bio-Rad 1610747 巯基乙醇 Sigma aldrich 60-24-2 Protein Marker 天能 180-6003 脱脂奶粉 生工 A600669 Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 21059 ECL Western Blotting Substrate Thermo Scientific 32106 3.2.3.2. 主要仪器主要仪器 仪器名称仪器名称 来源来源 型号型号 离心机 Thermo Scientific Micro17R 恒温金属浴 佑宁仪器 MiniH-100L 酶标仪 BioTek Epoch-256600 电泳仪 上海天能 EPS-300 凝胶成像系统 上海天能 Tanon-600 流式细胞仪 BD e126037 显微镜 奥林巴斯 CX23 3.3.3.3. 其他其他 根据实际情况选用合适的检测方法。解螺旋 4.4. 实验步骤实验步骤 4.4.1 1 形态学方法形态学方法 形态学检测主要是通过显微镜，观察细胞甚至是亚细胞层面的形态变化和形态学特征。 解螺旋 陪伴医生科研成长 3 常见的有光学显微镜，主要观察细胞缩小、核浓缩、细胞周围出现透明圈等现象；相差显 微镜，主要观察细胞鼓泡，凋亡小体的产生等现象。 基于光学的显微镜，主要还局限于细胞层面的形态学研究和鉴定。如果要涉及到亚细胞形 态，那就需要用到电子显微镜技术，例如透射电镜。通过透射电镜可以观察到细胞表面微 绒毛的消失、核染色质沿核膜分布、新月体形成及凋亡小体的形成等现象。 基于染色的观察： 吖啶橙染色后通过显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞 核染色质呈黄绿色凝聚在核膜内，还可见到细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 台盼蓝染色：台盼蓝染料不能透过完整的细胞膜。凋亡或坏死细胞，胞膜不完整，破 裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝。不变蓝的则为活细胞。 4.24.2 流式细胞仪检测（流式细胞仪检测（Annexin VAnnexin V- -PIPI 双染色实验）双染色实验） Annexin V-PI 双染色实验是用于检测凋亡的经典实验方法。在正常细胞中，磷酯酰丝氨酸 只分布在细胞膜的脂质双分子层的内侧。 当细胞发生凋亡的早期阶段， 磷酯酰丝氨酸从细胞 膜内侧外翻到细胞膜的外侧。解螺旋 通过 Annexin V-PI 双染色实验，再通过流式细胞仪进行检测，可以把细胞分为四种类型： 1）Annexin V 阴性且 PI 阴性（双阴性细胞） ，这类细胞是活细胞； 2）Annexin V 阳性且 PI 阴性，这类细胞是早期凋亡的细胞； 3）Annexin V 阳性且 PI 阳性（双阳性细胞） ，这类细胞是晚期凋亡或者是坏死的细胞； 4）Annexin V 阴性且 PI 阳性，这种情况可能是由于非特异性染色导致的。因为 Annexin V 阴性，表示磷酯酰丝氨酸没有外翻，说明细胞膜依然具有完整性。PI 不能透过完整性的细 胞膜和细胞核结合，因此从理论上讲，不存在 Annexin V 阴性而 PI 阳性的细胞。 解螺旋 陪伴医生科研成长 4 实验步骤： 1. 细胞按每孔 410 5个的密度接种于 60 mm 细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处 理细胞。 2. 胰酶消化收集细胞，并用 1 ml PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入 15 ml 管中。 3. 800 rpm 离心 5min, 去除上清，加 5 ml 的 PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重 复两次，最后重悬细胞于 0.5 ml 的 PBS 中。 4. 低速振荡器便震动边加入 5 ml 预冷的 70% 乙醇，固定，4 OC 过夜。 5. 次日将固定好的细胞以 1000 rpm 的转速离心 5min，弃上清，加入 4 ml 的 PBS 清洗一 次，用 0.4 ml 的 PBS 重悬细胞。解螺旋 6. 加入5 ul Rnase (10 mg/ml) 37 OC消化1小时， 加入终浓度50mg/ml碘化丙啶(propidium idodide PI)在 4 OC 避光染色过夜（或者 37OC 避光染色 1 小时） ，在流式细胞仪上分析。 4.3 4.3 核酸电泳检测细胞凋亡（核酸电泳检测细胞凋亡（DNADNA 片段检测法）片段检测法） 当细胞发生凋亡时，细胞中 DNA 发生断裂，小分子 DNA 片段不断增加，高分子 DNA 片段不断 减少，而且在细胞的胞浆内出现 DNA 片段。但是凋亡细胞 DNA 断裂的特点是，DNA 断裂不是 随机的，而是由于内源性的内切酶作用，因此 DNA 的断点都是规律性的发生在核小体之间， 因此出现的 DNA 片段都是 180-200bp 的片段或者是 180-200 bp 整数倍的 DNA 片段。在凝胶 电泳中，如果出现这种特征性的电泳条带，就可以判断细胞发生了凋亡。 4.4 4.4 凋亡明星分子检测凋亡明星分子检测 通常检测明星分子， 明星分子具体可参考 24 型-细胞凋亡， 实验方法采用的是 western blot 的方法、酶联免疫吸附法（ELISA） 。 解螺旋 陪伴医生科研成长 5 5.5. 典型文献典型文献 1. Liu X, Fu