3.植物叶绿体色素的分析.doc

中 国 海 洋 大 学 实 验 报 告 2015年11月03号姓名：白杰 专业年级： 2014级生物技术 学号组者：曹 昱课程： 植物生理学实验 题目：植物叶绿体色素的分析 一、实验目的学会叶绿体色素的提取分离方法，了解高等植物叶绿体色素的种类组成、性质，掌握叶绿素的定量测定方法。 二、实验原理叶绿体色素是植物捕获太阳能进行光合作用的重要物质，高等植物的叶绿体色素一般由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素等组成。叶绿体色素的提取是利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性,将待测的植物叶片用研钵研磨让植物组织破碎，利用丙酮的溶解能力将叶绿体色素溶于丙酮中，通过用滤纸过滤分离植物组织碎片，即可以得到叶绿体色素的丙酮粗提液。叶绿体色素的分离提纯一般用层析的方法，其中纸层析是最简单的一种。当溶剂不断地从纸上流过时，由于混合物中各成分在流动相和固定相间具有不同的分配系数，引起它们的移动速度不同，因而使混合物分离。叶绿体色素能够吸收一定波长的光，而让其他波长的光透过，这是叶绿体色素的光学特征之一,将色素的吸光度对波长作图，所绘制的曲线称为吸收光谱曲线。在80%丙酮的叶绿素混合提取液中，叶绿素a和叶绿素b在长波方面的最大吸收峰分别位于663nm和645nm，虽有明显差异，但吸收曲线彼此又有些重叠，在这种情况下，想要分别测得叶绿素a和叶绿素b的含量，可根据Lambert-Beer 定律，通过代数方法，消除一种组分存在时对另一种组分吸光度值的影响，最终分别求得两种组分的含量。由于663nm和645nm波长叶绿素的比吸收系数k为已知,根据 Lambert-Beer 定律,溶液中叶绿素浓度C与溶液的吸光度A之间的关系式为： A663=82.04C十9.27Cb (1) A645=16.75C十45.6Cb (2)解方程 (1)(2), 则得 CA (mg/L) = 12.7A663-2.69A645CB (mg/L) = 22.9A645-4.68A663 CT (mg/L) = CA + CB = 20.2A645 + 8.02A633式中 CT为叶绿素总浓度CA、CB分别为叶绿素AB浓度最后可根据提取液的体积、植物组织的鲜重，计算出样品叶绿素a和叶绿素b的含量 mg/g样品中：叶绿素a含量（ mg/g ）= 提取液叶绿素a浓度（mg/L)*提取液体积（L）/叶片重量（g）叶绿素b含量（ mg/g ）= 提取液叶绿素b浓度（mg/L)*提取液体积（L）/叶片重量（g）三、仪器试剂1仪器及用品分光光度计，研钵，漏斗，漏斗架，试管，试管架，量筒吸球，移液管，棕色瓶，层析装置，层析纸，电吹风，电子天平，容量瓶，酒精灯。2试剂80%丙酮，碳酸钙，四氯化碳，无水硫酸钠，20%KOH甲醇溶液，醋酸钠，盐酸石英砂四、实验材料菠菜叶片五、实验步骤一、叶绿体色素的定性实验实验内容实验现象及数据1、 色素的提取：取4.01g新鲜菠菜叶撕成碎片后于研钵中加5ml 80%丙酮、少许碳酸钙和石英砂，研成匀浆，再加入25ml丙酮，得到提取液将其过滤到棕色瓶中备用。2、色素的分离：准备滤纸条用毛细管吸取提取液划样至样带呈深绿色，样带宽度在3mm左右层析缸中加20mlCCl4和少量无水硫酸钠于层析缸中进行层析观察色素带分布绘图记录（点样时：若色素过淡可用吹风机吹干后再点数次）胡萝卜素叶黄素叶绿素a叶绿素b3、叶绿体色素的性质（1）荧光现象：取15ml色素提取液于试管中单一光源照射 观察反射光和透射光的颜色记录有红色荧光产生 （2）氢、铜在叶绿素分子中的代替作用：取少许色素提取液于试管中加两滴浓盐酸得去镁叶绿素，记录溶液颜色变化再加少许醋酸铜晶体，加热至稍沸，记录溶液颜色变化（3）皂化作用：取3ml上述色素提取液，加1ml 20%KOH甲醇溶液，小心加热到沸腾，冷却后，加入3ml水，混匀静止后得到两层溶液。（上层是苯的胡萝卜素和叶黄素溶液，下层是叶绿酸a和叶绿酸b的钾盐溶液。）另在3ml 上述色素提取液中直接加3ml苯混匀，再加3ml水，混匀静止后，对比皂化和没皂化溶液有何不同。左边皂化，右边非皂化二、叶绿体色素的吸收光谱曲线测定容内验实实验现象及数据1、色素的提取：取有代表性的菠菜叶片0.25g撕成碎片后于研钵中加5ml 80%丙酮、少许碳酸钙和石英砂，研成匀浆，再加入80%丙酮少许，混匀后静止，过滤于具盖试管中用80%丙酮研磨研钵中的残渣。静止后再过滤，如此重复数次。提取液无色，残渣呈浅黄色用80%丙酮清洗研钵、漏斗和滤纸，转移至试管中用80%丙酮定容至25ml得叶绿素提取液备注：整个提取过程最好在弱光条件下进行，得到的提取液应在暗处保存。取提取液稀释45倍后，以80%丙酮为空白对照在TU-1800紫外可见分光光度计上，于400700nm波长间测定吸收光谱曲线，然后在663nm和645nm波长下读取吸光度值。序号OD值123平均OD663nm0.7900.8010.8030.801OD645nm0.3370.3370.3380.337注意在使用分光光度计前先调零六、实验结果（1）叶绿体色素层析色谱图胡萝卜素叶黄素叶绿素a叶绿素b（2）叶绿素色素各项性质实验所观察到的现象荧光照射：反射光呈血红色氢、铜在叶绿素分子中的代替作用：A、叶绿素a的结构B、原理C55H72O5N4Mg+H+=C55H74O5N4+Mg+H+C55H72O5N4Mg+Cu+=C55H72O5N4Cu+Mg+C、现象向色素提取液中加入2滴浓盐酸后，溶液呈黄绿色（去镁叶绿素）；在上述黄绿色溶液中加入少许醋酸铜结晶并加热后，变为亮绿色，即铜代替了原来镁在叶绿素中的位置。皂化作用：（4）色素提取液的吸光度值测定记录Ca=9.26（mg/L)Cb=3.97（mg/LCT=13.2