一株产香真菌的筛选鉴定及脂肪酶基因序列克隆分析.doc

一株产香真菌的筛选鉴定及脂肪酶基因序列克隆分析 孙媛，余玉莎，李梦娇，周斌，张芬芬，李玲，王继英，赵明富，文国松 （云南农业大学，农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室；农学与生物技术学院，昆明； 云南大学微生物研究所，昆明） 摘要：从香料植物天竺葵上分离筛选到一株产香真菌，对该菌株进行鉴定，确定其分类地位，并克隆其产脂肪酶基因进行序列分析。结果表明，分离筛选得到的菌株形态为菌落圆形，质地疏松，菌丝由白色变为灰褐色，菌丝无隔膜，有假根，孢囊梗基部膨大形成球形孢子囊，孢囊孢子椭圆形；该菌株序列与米根霉（）相应片段的核苷酸序列同源性为。利用扩增得到脂肪酶基因，该基因编码区全长为，编码个氨基酸，脂肪酶核苷酸序列与推导的氨基酸序列与（）和（）聚为一支，支持强度分别达到和。结合形态学初步确定，产生浓郁甜酒香味的菌株为米根霉，能产生脂肪酶，克隆其脂肪酶基因全长。 关键词：真菌；筛选；脂肪酶；扩增 ：A：0439114（15）051227-05 ：05 ： 基金项目：云南省烟草公司项目“微生物菌剂在烟草病害防治中的应用研究”（） 作者简介：孙媛（），女，云南曲靖人，在读硕士研究生，研究方向为植物病理，（电话）（电子信箱）； 通信作者，赵明富，副教授，主要从事植物病理和微生物研究，（电子信箱）；文国松，副研究员，主要从事中药材研究， （电子信箱）。 脂肪酶（，）是一类特殊的酯酶，可以在油水界面上催化长链甘油酯水解为长链脂肪酸和甘油，在非水相系统中，可以催化转酯和酯合成等多种反应。通过改变反应体系的水含量便可以控制脂肪酶催化的反应方向，可以进行水解、酯合成、酯交换、转酯化等一系列反应。脂肪酶在常温常压下反应具有反应条件温和、转化率高和特异性强，不易产生副产物等特点，从而能避免化学催化带来的有害物质。因此，脂肪酶越来越多地运用于光学活性化合物和天然产物的合成，如在食品、饲料、洗涤、纺织、能源等加工业中应用广泛，成为重要的工业酶制剂之一。脂肪酶广泛存在于植物、动物和微生物中，其中微生物脂肪酶具有种类多、底物专一性类型多、独立的脂肪酶基因易获得等优点，因而微生物是脂肪酶的一个重要，其中根霉属（）是脂肪酶的重要生产菌。根霉属（）是一类分布较为广泛的真菌，属于接合纲毛霉目毛霉科，分布于酒曲、植物残体、腐败有机物、动物粪便和土壤中，在传统和现代发酵工业中有着重要作用。其中与生物技术相关的根霉有匍枝根霉（）、华根霉（）、德氏根霉（）和米根霉（）。目前已从根霉属中分离到超过种脂肪酶，如米根霉脂肪酶、雪白根霉脂肪酶、德氏根霉脂肪酶等，这些酶已经商品化，如根霉脂肪酶用于芳香酯6、生物柴油12、手性化合物3等有机化学物的制备，因此根霉脂肪酶具有一定的研究价值。 目前，已经从不同种属的微生物中分离得到产脂肪酶菌株，并对其进行了深入研究。随着分子生物学4的发展，国内外报道了不同微生物脂肪酶基因已被成功克隆5，通过数据库比对分析脂肪酶序列，可以发现在相同或者相近的种属内脂肪酶的同源性相对较高，从而找到相对保守的结构域。本研究从石林香料植物天竺葵叶表面分离到一株产脂肪酶菌株，通过提取基因组以真菌通用引物（）进行扩增，并结合形态学对该菌株进行鉴定，然后设计引物利用扩增米根霉脂肪酶全基因序列，并对分离菌株进行发酵代谢成分分析，为米根霉的运用提供了异源表达和分子育种材料，为其代谢产物的研究和开发奠定基础。 材料与方法 材料 菌株由石林香料天竺葵样品中自行分离、纯化并保存的菌株。 主要试剂和仪器酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、牛肉膏、乙酸乙酯、无水硫酸钠等均为国产分析纯；试剂盒、购自北京百泰克生物有限公司；引物合成及测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。仪器包括离心机、仪、旋转蒸发仪、美国型气质联用仪、色谱工作站、谱库等。 培养基酵母液体培养基：酵母膏、蛋白胨、葡萄糖，加水定容至。酵母固体培养基：酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂粉，加水定容至。油脂培养基：蛋白胨、牛肉膏、香油、中性红水溶液、琼脂，加水定容至，。发酵液体培养基：蓖麻油、吐温、市售麦芽粒，加水定容至。 方法 产香菌株的分离和筛选将天竺葵的叶片用无菌剪刀由叶柄端剪下接种于装有已灭菌的酵母液体培养基的三角瓶中，置于恒温培养箱中富集培养，待培养基变浑浊，样品表面形成菌时将其进行梯度稀释，涂布于新鲜的酵母固体培养基平板上，置于恒温培养，待长出菌落后进行纯化培养并将其接种于发酵液体培养基中，置于恒温摇床培养，通过嗅觉初步判断发酵液是否产生香味，斜面保存菌种。 利用因改变而变色的化合物作为指示剂对产脂肪酶菌株进行筛选，先将分离、纯化的菌株接种于酵母固体培养基平板中，置于培养箱中恒温培养，进行菌种活化，待其生长后再将其接种于油脂培养基平板中，置于培养箱中培养，待菌生长后观察平板底层，如果出现红色斑点则为阳性，说明有脂肪酶产生。 产香菌株的形态学观察和鉴定 ）形态学观察。将菌株接种于酵母培养基平板上，于恒温培养。参考真菌分类学鉴定手册6对菌落形态和显微形态进行观察。 ）提取和序列扩增。用酵母培养基平板培养，待其生长后刮取并收集菌丝，根据He7法提取该菌株基因组总，略有改进。以提取的总为模板，用通用引物（）和（）进行扩增。采用试剂盒，扩增总体系？滋。反应体系：？滋，上、下游引物各？滋，？滋，？滋。扩增条件：，；，；，；，共个循环；，。产物采用琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增的产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果在上进行比对，并用软件进行多序列比对，再提交序列至，获取登录号。 脂肪酶基因扩增及其序列分析以提取的基因组总为模板，根据脂肪酶高度保守序列的引物、（表）对该基因进行扩增，扩增体系同上，采用试剂盒。扩增条件：，；，；，；，个循环；，琼脂糖凝胶电泳检测并对扩增的产物进行测序。 根据测序结果在上对保守序列进行比对，选取同源性高的菌株，利用软件对选取菌株进行比对，寻找保守序列。利用软件根据保守序列设计引物、（表），对该菌脂肪酶基因进行扩增，扩增体系同上。反应条件：，；，；，；，个循环；，。琼脂糖凝胶电泳检测并对扩增的产物进行测序。 根据测序得到的上述次核苷酸序列拼接设计引物（表），利用引物、扩增该脂肪酶的全基因序列，扩增体系同上。反应条件：，；，；，；，个循环；，琼脂糖凝胶电泳检测并将扩增的产物送去测序。测序结果在上进行比对，利用搜索数据库中与该序列同源性较高的菌株序列，采用软件进行多序列比对，利用软件以法构建产脂肪酶菌株的系统发育树，值为。 结果与分析 产香菌株的分离、筛选 利用酵母液体培养基对天竺葵的叶片进行富集培养，酵母培养基变浑浊，样品表面有菌形成，将其进行梯度稀释涂布于酵母固体培养基中培养，成功分离得到菌株，对其进行纯化。再将分离、纯化的菌株接种于发酵液体培养基中进行产香筛选，培养后对其发酵液进行产香嗅觉初步判断。结果发现，分离、纯化得到的菌株能产生浓郁的甜酒香味，成功筛选得到一株产香菌株。将分离、纯化的产香菌株命名为。将菌株接入油脂培养基平板培养，以筛选产生脂肪酶的菌株，经过恒温培养观察到菌株平板底层出现红色斑点，如图所示。由此可见，该菌株为脂肪酶产生菌。 产香菌株的形态学和鉴定 菌株在酵母培养基培养后，菌落圆形，质地疏松，菌丝由白色变为灰褐色；在显微镜下观察到菌丝无隔膜，有假根，孢囊梗基部膨大形成球形孢子囊，孢囊孢子椭圆形，如图所示。参考真菌分类鉴定手册，初步确定为根霉属。以菌株的为模板，利用真菌通用引物进行扩增并对相应产物进行测序。测序结果表明，该菌株长度为，将序列提交获得登陆号为。利用软件将所得基因序列与数据库的序列进行同源性比较分析，利用进行多序列比对，结果见表。分析结果表明，菌株与（）菌株的同源性较高，达到，菌株与米根霉可能具有共同的起源。 脂肪酶基因扩增及系统发育分析 以提取的总为模板，利用引物、进行脂肪酶基因扩增，结果得到约的扩增产物，与预期结果一致。根据测序结果在上对保守序列进行比对，选取同源性高的菌株，利用软件对选取的菌株进行比对，寻找保守序列。利用软件设计的引物、对该菌脂肪酶基因进行扩增，结果得到约的扩增产物，与预期结果一致。 根据次测序结果拼接核苷酸序列设计引物，利用引物、扩增完整的目的基因，经测序、拼接得到完整的脂肪酶基因，该脂肪酶基因片段大小为，编码个氨基酸。经过次扩增，成功扩增得到脂肪酶基因，并利用凝胶成像系统观察，结果如图所示。 将扩增得到的序列与数据库中序列进行比对，选取比对的组核苷酸序列进行系统发育分析，用软件以法构建产脂肪酶菌株的核苷酸系统发育树，结果如图所示。结果表明，菌株与（）和（）聚为一支，支持强度达到，同源性分别达到和，与其同源性最低的是（），同源性为，可以看出脂肪酶在遗传距离上与比较近，与较远。 将扩增得到的米根霉脂肪酶基因序列翻译成氨基酸序列后，利用软件构建产脂肪酶菌株的氨基酸系统发育树，结果如图所示。由图可知，菌株与（）和（）聚类成一支，支持强度达到，同源性分别达到和，与其同源性最低的是（），同源性为。由此可知，无论在核苷酸水平还是氨基酸水平上，扩增得到的脂肪酶都与脂肪酶具有较高的相似性，因此初步认为扩增得到的脂肪酶基因为米根霉脂肪酶基因。 小结与讨论 米根霉脂肪酶具有高度的、位置特异性，可以水解和再合成三甘油酯的第一位酯键，可以用来水解、重组脂肪和油脂，在芳香酯、手性化合物、生物柴油等有机物的合成中具有较高价值。伴随着脂肪酶的商业价值问题也是突出的，其中包括天然菌株产脂肪酶产量低，酶与菌体分离纯化困难，产物纯度达不到工业化生产要求等问题，因此利用分子生物学手段扩增脂肪酶基因作为一种高效表达的生产方法已经成为研究的热点。 本研究从采集的香料植物天竺葵样品中分离得到一株产脂肪酶菌株，通过对该菌进行形态学观察和序列测定，测序结果表明该菌株与米根霉（）具有最高的遗传相似性，再结合形态学可以确定该菌株为米根霉。通过扩增该菌株脂肪酶基因和数据库比对，发现扩增得到的脂肪酶基因与提交的（）和（）脂肪酶核苷酸和氨基酸序列具有着较高的同源性。说明本研究成功扩增得到全长为，编码个氨基酸的基因可能为米根霉脂肪酶基因，为挖掘我国的产脂肪酶微生物及其对脂肪酶的研究提供了材料。 菌株在发酵培养基培养过程中，能产生浓郁的甜酒香味，这种香味的存在可能与菌株产生的某种或某些代谢产物有关，同时菌株代谢过程中产生的甜酒气味可能与脂肪酶的存在有着某种联系，这对米根霉产香化合物的发酵优化提供理论指导。探究该菌产香化合物的发酵优化及其产生的有关代谢产物组成，并对产香代谢化合物进行分离、提纯将成为后期研究的内容。 参考文献 谈重芳，王雁萍，陈林海，等微生物脂肪酶在工业中的应用及研究