HPLC法测定维C银翘片中牛蒡苷和连翘苷的含量.doc

HPLC法测定维C银翘片中牛蒡苷和连翘苷的含量 张武圣 河南省中医院，河南郑州450006 【摘要】目的：建立测定维C银翘片中牛蒡苷和连翘苷的含量测定方法。方法：采用高效液相法，色谱柱为DiamonsilC18柱（250nm4.6mm，5m），以乙腈0.2%磷酸水（3070）为流动相，检测波长：207nm，流速：1.0ml/min；运用外标法对其进行测定。结果：牛蒡苷线性回归方程为Y=67716X-264370，在95.4ng1980ng范围内线性关系良好（r=0.9995），连翘苷性回归方程为Y=96437X-716504，在21.18ng423.6ng范围内线性关系良好（r=0.9991），牛蒡苷和连翘苷加样回收率99.66%、99.48%，RSD分别为0.90%和0.94%。3批维C银翘片牛蒡苷平均含量分别为10.17、10.06、10.21mg/g，连翘苷平均含量1.97、1.84、2.03mg/g。结论：该方法准确、简便、重复性好、灵敏度高，可用于对维C银翘片的质量评价及质量控制。 关键词维c银翘片；牛蒡苷；连翘苷；高效液相色谱法 【】R284.1【文献标志码】A【】1007-8517（xx）04-0028-02 维C银翘片是常用的中成药，由金银花、连翘、牛蒡子等多味药物制成，具有疏风解表、清热解毒等功效，常用于外感风热所致的流行性感冒及发热、头痛、咳嗽、口干、咽喉疼痛等症。该药功效明确，且连翘、牛蒡子在复方中均起到重要作用。研究表明，牛蒡苷为牛蒡子的有效成分，具有改善糖尿病微血管病变1、抑制肾小球纤维化2和抗癌3等作用；连翘苷为连翘的主要成分，具有抗氧化4、抑制甲型流感病毒NP基因转染后表达5和退热作用6等。本文测定维C银翘片中牛蒡苷和连翘苷的含量，建立通过HPLC对其质量控制的方法，为以后维C银翘片的研究提供依据。 1仪器与试药 1.1仪器Waters2695高效液相色谱仪（配Waters2998紫外检测器，Empower色谱工作站）；CPA2P-F电子分析天平（东方嘉仪电子科技有限公司）；DL-360A超声清洗机（上海之信仪器有限公司）；SHZ-D（）型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；HH-6双列六孔数显恒温水浴锅（上海博珍仪器设备制造厂）；EYELAN-1100旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）。 1.2试药维银翘片（批号：110503、110602、110901，广西盈康药业）；牛蒡苷对照品（批号：110819-xx08）、连翘苷（批号：110821-xx12）由中国药品生物制品检定所提供；乙腈（色谱纯，GraceCompanyINC）；甲醇（分析纯，天津四友精细化学品有限公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。 2方法与结果 2.1色谱条件色谱柱：DiamonsilC18柱（250nm4.6mm，5m）；柱温：25；流动相：乙腈-0.2%磷酸水（3070）；检测波长：207nm，理论塔板数按连翘苷峰计算应不低于2000。 2.2对照品溶液的制备取牛蒡苷和连翘苷适量，精密称定，分别加50%甲醇将其制备成浓度为0.2118mg/ml的连翘苷对照品溶液和0.954mg/ml的牛蒡苷对照品溶液。制备的对照品溶液各取1ml置10ml定量瓶中，加50%甲醇定制刻度，即得混合对照品溶液。 2.3供试品溶液的制备取本品数片，去除包衣，碾磨混匀，精密称取5g置具塞锥形瓶中，加甲醇25ml，称量质量，超声处理30min，放冷，补足失重，摇匀过滤，取续滤液10ml，加置中性氧化铝柱（100120目，2g，内径0.9cm）上，用50%甲醇洗脱，收集洗脱液置25ml定量瓶中，即得。 2.4阴性对照溶液的制备按处方量制备不含牛蒡子和连翘的阴性对照药材，按“2.3”方法进行处理，得阴性对照溶液。 2.5专属性试验精密吸取对照品、供试品及阴性对照溶液各10l，注入高效液相色谱仪进行测试，结果阴性对照色谱中，在与对照品和药材出峰时间处没有相应的色谱峰，表明其他组分对牛蒡苷和连翘苷无干扰，结果见图1。 2.6线性关系考察按以上色谱条件，分别用自动进样器进1、2、4、8、10、20l，按以上色谱条件下进行测定，以峰面积为纵坐标，以对照品进样量为横坐标，得到线性回归方程牛蒡苷：Y=67716X-264370，r=0.9995，说明牛蒡苷对照品在95.4ng1980ng范围内线性关系良好；连翘苷：Y=96437X-716504，r=0.9991，说明连翘苷对照品在21.18ng423.6ng范围内线性关系良好。 2.7精密度试验取同一对照品溶液，连续进样5次，每次10l，分别记录牛蒡苷和连翘苷的峰面积，计算其精密度的RSD分别为1.61%、1.84%，表明仪器的精密度良好。 2.8重复性试验取维C银翘片样品5份，按“2.3”项方法将其制备成供试品并按照上述色谱条件测定牛蒡苷和连翘苷的含量，记录牛蒡苷和连翘苷的峰面积，计算RSD值分别为2.01%和2.14%，表明重复性良好。 2.9加样回收率试验取已知含量（含10.17mg/g牛蒡苷和1.97mg/g连翘苷）的维c银翘片约0.5g，共9份，精密称定，分为3组，每组分别精密加入质量浓度已知的牛蒡苷对照品和连翘苷对照品0.8、1.0、1.2倍，按照以上供试品的制备方法制备供试品以及按上述色谱条件进行测定，结果显示牛蒡苷和连翘苷的加样回收率的RSD分别为0.90%和0.94%，见表1、2。 2.10样品的含量测定取3批维银翘片品（110503、110602、110901），每批取6份，按照以上制备方法及色谱条件测定，记录色谱峰面积并计算，测定结果见表3。 3讨论 3.1流动相的考察实验中对不同系统的流动相进行了筛选考察，包括乙腈-水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、甲醇-水溶液，结果表明：把乙腈-0.2%磷酸水作为流动相时效果最佳，色谱峰峰型及分离度均良好，且保留时间适宜，故选择乙腈-0.2%磷酸水作为流动相。 3.2提取方法的考察维C银翘片为中药复方制剂，本实验主要对其进行了超声法和回流法进行对比，结果发现超声法与回流法对二者含量影响不大，但由于超声法操作简便，故选其为提取方法。 3.3吸收波长的考察维C银翘片中牛蒡苷6在208、224、280nm处均有最大吸收，连翘苷7在205、288、277nm处有吸收，通过综合考察，发现其二者在207nm处峰形较好，杂质干扰少，故选择波长为207nm。 3.4层析柱的选择因维C银翘片中待测成分的含量较低，故选择过层析柱以防止其他成分干扰致使其含量测定不准确，本实验通过对聚酰胺、大孔吸附树脂、中性氧化铝等填充料进行选择，从测得含量高、杂质干扰少的角度，最终选择中性氧化铝为填充料的层析柱进行试验。 维C银翘片是中药制剂，因其良好的疗效而受到广泛的应用。本次实验通过HPLC法对维C银翘片中牛蒡苷和连翘苷进行含量测定，从而更科学合理的对维C银翘片中两种成分进行质量标准控制，且本实验设定的方法灵敏度高，专属性好，可以为维C银翘片中牛蒡苷和连翘苷的含量测定提供方法依据。 参考文献 1付元元，赵语牛蒡子苷对糖尿病微血管病变的作用机制研究进展J重庆医学，xx，（21）：2813-2815 2李俊，董鑫鑫，罗颖颖，等牛蒡苷胶囊对阿霉素肾病大鼠的保护作用J中国实验方剂学杂志，xx，18（7）：160-163 3冯思嘉，吕晓红，杨树才，等牛蒡子苷元对人膀胱癌T24细胞增殖、侵袭转移的影响J解剖学杂志，xx，35（6）：729-732 4秦宇，张文丽，林媛媛，等连翘化学成分与抗氧化活性研究J中国实验方剂学杂志，xx，19（11）：127-130 5段林建，张清，王农荣，等连翘苷对甲型流感病毒核蛋白基因表达的影响研究J中国全科医学，xx，15（18）：2082-2084 6王建明，赵楚文双黄连制剂中连翘苷含量与退热作用相关性研究J中国药师，xx，13（10）：1405-1408 7廖晓鸣，郑丹，宋志娟，等HPLC测定荆菊感冒片中牛蒡苷的含量J中国实验方剂学杂志，xx，18（4）：113-115 8