实验一质粒DNA的提取.ppt

实验一 质粒DNA的提取,实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论,实验目的,了解碱法提取质粒的原理； 掌握碱法提取质粒的方法； 掌握DNA琼脂糖电泳的原理和方法。,实验原理,质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。 这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。,结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制单位 种类： 质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC） 反转录病毒载体 表达载体等,pET-32a Vector,The pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant proteins in E. coli.,pET-32 cloning/expression region,Vector (pET-32a),Gene fragment (SmPR10),pET-32a-SmPR10,质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。 当菌体在NaOH和SDS溶液(碱性条件pH 12.5)中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同，染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入乙酸钾溶液pH恢复至中性时, 在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。,实验仪器、材料与试剂,（一） 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器,（二） 材料,大肠杆菌E. coli DH 5含重组质粒 pET-32a-SmPR10,（三） 试剂,1. LB液体培养基（1L） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml，搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。 LB固体培养基（1L） 在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。,2. 溶液：葡萄糖（50mmol/L ）；TrisHCl（ 25mmol/L， pH8.0）； EDTA （10mmol/L） 3. 溶液： NaOH （0.2mol/L） ；SDS （ 1%，新鲜配制） 4. 溶液： 60ml的 5mol/L KAC ； 11.5ml的冰醋酸 ； 28.5ml H2O,溶液I：低浓度的葡萄糖溶液使细胞处于低渗状态而细胞澎胀；葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA。 EDTA的作用是螯和掉Mg2+、Ca2+等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。 TrisCl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。,溶液II：SDS的作用：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。 NaOH(pH12)的作用：破坏氢键，使DNA分子变性。,溶液III：由KAc与HAc组成，是pH值为5.5的高盐溶液。能中和溶液II的碱性，使DNA复性。但是质粒DNA与染色体DNA复性的速度不同。K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离。,5. 氨苄青霉素（Amp） 用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20冰箱保存备用。 6. RNaseA 将RNA 酶 A溶于10 mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中， 配成10 mg/ml的浓度，于100加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20。 7. 酚/氯仿(1:1)，氯仿/异戊醇(24:1)，乙醇 ，75%乙醇。,实验步骤,质粒的提取 1. 用灭菌的牙签挑取单菌落放入1-2ml LB液体培养基（含Amp 0.1 mg/ml ）中，37振荡培养过夜。 2. 将菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中，10,000 rpm离心1min，弃上清液。 3. 加入100 l SolutionI，涡旋使细胞充分悬浮。 4. 加入200 l SolutionII，立即上下颠倒离心管5-10次，使之混匀（注意动作轻），冰上放置5min。 5. 加入150 l SolutionIII，立即上下颠倒离心管5-10次，使之混匀（注意动作轻） ，冰上放置5min。,6. 15,000rpm，离心10min，将上清移至一干净的1.5 ml Eppendorf 管中，注意所取体积（约400 l ） 。 7. 加入等体积酚/氯仿（1:1），颠倒数次混匀（注意动作轻），12,000rpm，4，离心3min，取上清液。 8. 小心吸取上清液中至一干净的1.5 ml Eppendorf 管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），颠倒数次混匀， 12,000rpm，4，离心3min，取上清液。,9. 小心吸取上清液中至一干净的1.5 ml Eppendorf 管中，加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，于冰上放置10min， 4离心，15,000rpm，10min。 10. 弃上清，加1ml 75%乙醇漂洗沉淀， 4离心，10,000rpm，5min。 11. 去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干燥沉淀。 12. 加入50 l TE buffer，室温振荡溶解质粒DNA。,培养细菌使质粒扩增,1. 挑取琼脂培养板上的单菌落至2ml LB培养液中（含Amp100 g/ml) 37摇荡培养过夜。 2. 取1ml菌液转接到一个含有100 ml LB培养液三角瓶中(含 Amp100 g/ml ）, 37摇荡培养过夜。,37 振摇过夜,37 振摇过夜,Tiangen质粒DNA 小量提取试剂盒（实际用） 操作过程 1. 柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500 l 的平衡液BL，12,000 rpm 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 2. 将1-2ml 过夜培养的细菌菌液加入1.5ml 离心管中，12,000rpm离心1分钟，并弃去上清液。如有需要，可多次重复步骤2，以收集更多细菌菌体。但勿过量，以免影响提取质粒的质量。 3. 加200 l 溶液P1（用前检查是否已加入RNase A），重悬细菌体沉淀，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。,4. 加200 l 溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意不要剧烈振动，以防止基因组DNA 被打断，注意不要让反应持续超过5 分钟。 5. 加300 l 溶液P3，立即轻柔颠倒离心管6-8 次，充分混匀，此时溶液应该出现白色絮状沉淀。 6. 12,000rpm离心10 分钟。 如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀。 7. 将步骤6 离心后得到的上清液转移到吸附柱CP3中，12,000rpm离心30-60秒，并弃去接液管内液体。 8. 向吸附柱CP3 内加600 l漂洗液PW ，12,000rpm 离心30-60 秒，并弃去收集管内废液。 9. 重复第8 步一次。,10.将吸附柱CP3 放入收集管中，12,000 rpm 离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 11.将吸附柱CP3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加40 l洗脱缓冲液EB，室温放置2