辅助生殖PGD与PGS技术.ppt

植入前遗传学诊断及筛查技术临床应用,谭跃球 tanyueqiu,中南大学生殖与干细胞工程研究所*人类干细胞国家工程研究中心 * 中信湘雅生殖与遗传专科医院,内容概要,一、植入前遗传学诊断与筛查的概念,PGD (Preimplantation Genetic Diagnosis)：又称为孕前诊断(preconception genetic diagnosis, PGD)。指在胚胎植入前，利用DNA分析技术对显微活检的胚胎细胞进行染色体异常或遗传性疾病进行诊断，选择正常的胚胎植入。,第一部分 植入前遗传学诊断和筛查的概念,第三代试管婴儿？,PGD/PGS是以ICSI-ET为基础，结合显微操作技术和分子生物学研究的而发展起来的。,PGD的意义,PGD可在孕前阶段杜绝X-连锁隐性遗传病、染色体病和基因病患儿的妊娠，避免人工流产终止异常妊娠给广大妇女的身心痛苦。 理论上还可减少遗传病在人群中的遗传负荷。 PGD是遗传性病防治的重要手段，是Edwards获诺贝尔奖的理由之一。,植入前诊断,传统的产前诊断,PGD发展历程,最早于1965由Edwards提出。 1968年Gardncr和Edwards在显微操纵下对兔囊胚进行活检，取出少量滋养外胚层细胞分析染色质来选择雌性胚胎。 1990年Handyside报道了世界第一例植入前性别诊断婴儿的出生，开创了产前诊断的新纪元。 1994年，Munne用FISH技术，在植入前诊断胚胎染色体非整倍体及性别获得成功。 1999年，Terlin等用巢式PCR和单链多态性分析技术，对单细胞进行视网膜母细胞瘤的易感性分析，在植入前确定胚胎未来发生肿瘤的可能性大小，从而为PGD应用于人类胚胎基因表达的研究开辟了崭新的途径。 2001年Verlinsky有报道对胚胎进行HLA选型以便于骨髓移植。进一步拓宽了该技术的研究和应用。,染色体异常（罗氏易位、相互易位、倒位等） 染色体异常的筛查 单基因病（一般的单基因病、性连锁遗传病等） 单基因异常的筛查,PGD期望解决的问题,植入前遗传学筛查的概念,胚胎植入前遗传学筛查（Preimplantation Genetic Screening, PGS），是指胚胎植入着床之前，对早期胚胎进行染色体数目和结构异常的检测，通过一次性检测胚胎23对染色体的结构和数目，挑选正常的胚胎植入子宫，以期获得正常的妊娠，提高患者的临床妊娠率，降低多胎妊娠。 PGS目前特指针对染色体数目异常，即非整倍体； PGS理论上将来可以应用于单基因病。 PGS是低风险人群，夫妻双方的染色体或者基因是正常的。,二、PGD检测流程,极体活检,活检第一极体和第二极体，检测母源性的染色体结构异常或基因突变，以及减数分裂异常造成的染色体非整倍体。 优点：对卵母细胞的发育没有影响。 缺点：只能检测母源性的染色体异常； 不能检测受精后发生的染色体异常； 可检测细胞数少，易发生检测失败。,（一）活检技术选择,卵裂球活检,在D3胚胎发育到6-10细胞时活检出1-2个卵裂球，进行遗传学诊断。 优点：最成熟最常用的活检方法。 缺点：活检出卵裂球后降低了胚胎的发育潜能； 细胞数少，容易发生检测失败(细胞固定及 杂交失败，扩增失败，ADO等)。,囊胚活检,D5-6天胚胎发育到囊胚阶段后，活检囊胚滋养层细胞进行遗传学检测。 优点：对滋养层细胞的活检不影响将要发育成胎 儿的内细胞团的发育； 可检测细胞数较多，检测失败概率降低。 对SNP-array而言，能大大减低费用。 缺点：大部分情况下（除非可以在24小时之内出结果） 需将活检后的囊胚冷冻保存。,染色体易位(Translocation):一种染色体结构异常，一条染色体的一段转移到同一条或另一条染色体上，导致易位片段基因的重排 (ThompsonThompson GENETICS IN MEDICINE 2010) 易位是一种常见的染色体结构重排异常，新生儿中发病率0.2%.(Stern et al., 1999) 临床上两种类型的易位最常见：罗氏易位和相互易位,一、染色体易位携带者的FISH-PGD,第二部分 植入前遗传学诊断的临床应用,4q25,20q12,相互易位： 两条非同源染色体之间进行片段的交换，常常是整个末端的断裂并互换。 - ThompsonThompson GENETICS IN MEDICINE 2010,Derivative chromosome 4,Derivative chromosome 20,罗氏易位： 这种类型的易位是在两组端着丝粒染色体 (D组 and G 组, 染色体13-15, 21-22)间进行交换，往往在靠近着丝粒的区域断裂重组，导致易位的两条染色体随体的丢失 -ThompsonThompson GENETICS IN MEDICINE 2010,Centromere,Centromere,Chr21,Chr14,der(14;21),易位携带者的健康风险,平衡的染色体易位个体往往没有明显的疾病表型，称为“易位携带者”。但却多存在生殖的障碍； 易位携带者主要的遗传风险起源于配子减数分裂的过程，携带者可产生高比例的不平衡配子（精子和卵），可以导致流产，出生染色体异常患儿引起出生缺陷（特别是智力障碍），并可导致不孕和不育；,平衡易位携带者的遗传风险,四射体,对于相互易位携带者，配子分离模式理论上产生18种配子类型：包括1种正常, 1种平衡易位型 和16 种不平衡分离的配子。,罗氏易位产生6种配子类型，包括1中正常，1中平衡易位型，其余4种不平衡分离配子，这类不平衡配子往往导致流产。,罗氏易位的遗传风险,染色体易位和生殖健康,反复流产： 3-4%的反复流产患者存在染色体结构异常 相互易位占 61% 罗氏易位占 16% - Clifford et al. 1994; Franssen et al. 2005 我院数据：共发现1425 易位携带者，其中相互易位 76.6% (1094/1428)，罗氏易位 23.4% (334/1428). 反复流产 75.2% (1071/1425) 严重男性因素 17.2% (245/1425) 卵巢功能下降1.2% (18/1425),PGD用于易位携带者治疗的历史,产前诊断移植以来被有效的用来避免染色体异常患儿出现，但是诊断异常后流产给妇女带来心理和生理的负担，并可能导致生育障碍； 第一例PGD的成功妊娠，利用Y染色体特异性DNA扩增技术成功对人胚胎性别进行诊断并获得妊娠。 - Handyside, AH. Nature,1990 1998年，FISH技术被用于易位携带者的PGD诊断并获得成功 - Conn CM et al. 1998; Munn S et al.1998;Pierce KE et al. 1998,荧光原位杂交(FISH),荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization, FISH）是以利用荧光标记的特定基因或染色体片段作为探针，与染色体特定序列DNA分子杂交，可以确定分裂细胞或间期细胞对应染色体序列的位置及数目，以此检测染色体数目或结构异常。 FISH技术有以下几个特点： 安全、快速、灵敏度高； 探针能较长时间保存； 多色标记，简单直观； 可用于中期染色体及间期细胞的分析,人类干细胞国家工程研究中心 * 中信湘雅生殖与遗传专科医院,荧光原位杂交(FISH-PGD),技术流程,欧洲生殖与胚胎学协会(ESHRE) -FISH-PGD实践指南,ESHRE要求： 实验室胚胎活检技术； 遗传室细胞核玻片固定基础，并对固定程序有详细要求； 选择合适的探针，对平衡易位患者需提前做好外周血淋巴细胞中期分裂相预实验；,欧洲生殖与胚胎学协会(ESHRE) -FISH-PGD实践指南,细胞核玻片固定程序： 活检卵裂球(1枚或2枚)或囊胚滋养层细胞(TE)； 低渗液滴中处理5min； 在圆圈标记对应的玻片正面部位加固定剂(Tween-20/HC1)，将低渗好的细胞转至固定剂液滴中； 待固定剂完全干燥后，可放在-20备用，或者直接进入下一步； 60烤片，30min-3h；RNase消化，蜡膜封片，湿盒中37度孵育30min-1h； 将RNase处理后的玻片依次过2xSSC、75%、90%、100%酒精，梯度脱水； 将玻片放入变性液中，75预变性3-5min（目的是将DNA双链打开）； 玻片依次过75%、90%、100%酒精梯度脱水，2min/浓度，完全风干； 探针75变性5min； 将探针加到风干的玻片样本上，双层蜡膜封片，置于湿盒中，37过夜（杂交4-6h）； 玻片依次过洗涤液WS1三缸(45)，WS2两缸（室温），WS3一缸（室温）； 75%、90%、100%酒精梯度脱水，风干； 加入DAPI，处理3min后，直接荧光显微镜下观察。,欧洲生殖与胚胎学协会(ESHRE) -FISH-PGD实践指南,平衡易位探针选择和淋巴细胞预实验 探针的选择：商业探针的使用需通过QC质控；自制探针也需要进行合适的QC/QA鉴定。 所有探针在应用到临床检测前都需经过细胞杂交预实验，评估特异性、亮度及弥散度； 对于所有平衡易位携带者，需要取用对应易位区段合适的探针以及探针组合对夫妻双方淋巴细胞中期分裂相及间期核进行预实验检测： 至少分析20个中期分裂相，确保探针位置在正确的染色体上，易位片段能被正确指示； 至少分析100个间期核，评估特异性、亮度及弥散度。,欧洲生殖与胚胎学协会(ESHRE) -FISH-PGD实践指南,一例相互易位携带者PGD，核型为： 46,XY,t(6;10)(q13; p15)，活检2枚胚胎，对单卵裂球进行FISH检测，发现1枚信号正常，移植1枚，妊娠单胎，产前诊断为正常核型，已出生正常婴儿。,FISH-PGD举例：平衡易位携带者,预实验结果：外周血淋巴细胞培养制备的一个中期分裂相和一个间期核 FISH探针：易位片段的亚端粒探针（6q136qter，Tel 6q SpectrumOrange；10p1510pter， Tel 10p SpectrumGreen）和10号着丝粒片段的着丝粒探针（10p1510qter,blue CEP10 alpha satellite SpectrumAqua）。,一例相互易位携带者PGD，核型为： 46,XY,t(6;10)(q13; p15)，活检2枚胚胎，对单卵裂球进行FISH检测，发现1枚信号正常，移植1枚，妊娠单胎，产前诊断为正常核型，已出生正常婴儿。,FISH-PGD举例：平衡易位携带者,FISH-PGD检测结果：不同通道滤光片下观察到的细胞核中的FISH探针荧光信号。a胚胎细胞核中每个探针均为2个杂交信号提示每个探针位点均为2个拷贝，表示易位相关的染色体组成为正常或平衡易位。b胚胎核中均为1个红色信号、3个绿色信号和2白色信号，分别提示6号易位片段为一个拷贝、10号易位片段为3个拷贝和10号着丝粒片段为2个拷贝，表示该胚胎为临近-1分离形成的6q136qter单体和10p1510pter三体不平衡产物。,临近-1分离模式图,2006-2011 年我院易位携带者进行d3 FISH-PGD结果,2006-2011 年我院易位携带者进行d3 FISH-PGD结果,单卵裂球FISH几种风险可能导致没有准确结果：,杂交背景干扰太强的情况,杂交杂质信号干扰的情况,杂交失败未见信号的情况,固定或重杂交细胞核丢失的情况,囊胚FISH相对卵裂期FISH更有优势？,1.活检细胞数的增多有利于信号的判定； 2.直观方便检出胚胎嵌合体。,囊胚FISH-PGD举例：平衡易位,FISH面临的挑战,不同实验室FISH检出率和准确率波动较大,着床率和妊娠率随着FISH检测错误率的上升而降低,FISH技术局限,FISH技术仅能检测有限的染色体，因此患者经FISH-PGD成功妊娠，但仍不可避免因其它未检测的非整倍体异常妊娠而引发的早期流产或出生缺陷。,FISH-PGD早期流产胚胎进行比较基因组杂交检测，检出5号染色体重复。,需要全染色体筛查为基础的PGD技术？,二、基于全染色体筛查的PGD(PGD-CCS),PGD with Comperhansive Chromosome Screening，避免了FISH仅能检测少数染色体的限制，采用全染色体筛查的方式对易位或倒位携带者进行PGD诊断，同时排除其它染色体非整倍体异常。,易位携带者的SNP-PGD临床情况总结,1. 囊胚+SNP活检分析增加PGD诊断的准确性,2. 基于SNP的PGD-CCS可以检测出除易位染色体外其他染色体的异常，减少流产,易位携带者SNP-PGD的临床结局总结,共分析360 个患者年龄在2044岁之间，平均新发生异常的几率是27.2%,Age,是否SNP-PGD需要用于每个易位携带者?,Comparison D5-FISH and d5-SNP results in translocation carriers 35 yrs,对于年轻的罗氏易位携带者，d5 FISH 能获得d5 SNP相似的临床妊娠结局,新一代测序技术(NGS)正逐步兴起,婚前,孕前,植入前,产前,新生,孕期指导,新夫妇家庭计划指导,低成本同时检测 40种代谢疾病，可覆盖大规模人群 建立国家和地区发病率数据库 确认诊断疾病，特别是稀有疾病 疾病亚型分类，或鉴别相似表型的不同疾病，进行有效干预 拯救婴儿生命，使他们更健康 减少对社会和家庭带来的负担,减少出生缺陷,指导意义,Next Generation Sequencing(NGS),NGS-PGD/PGS技术路线,WGA,SNParray检测,NGS检测,平行实验,已知样本,非整倍体单个胚胎干细胞,正常核型淋巴细胞,FISH-PGD诊断为异常的胚胎重活检淋巴细胞,全基因组扩增获得产物,临床并行实验,SNParray检测,NGS检测,建立平台,评估检出率，准确度等指标，芯片与测序相当,方法学的建立,2X 测序深度能覆盖60%人类基因组，10X深度能覆盖90%人类基因组。 等位基因脱扣ADO率约5-20%；平均值为4%，近着丝粒区段发生ADO率相对较高。 碱基对检出误差：C:GT:A.,Before after GC bias correction,专为单细胞测序 CNV 分析而设置的算法，矫正WGA产生的GC偏差，使结果更接近基因组DNA测序水平。,NGS vs SNParray 在非整倍体与16M缺失重复的比较,方法学的建立,技术特点,高通量，高准确度：使用新一代测序技术，克服PCR技术通量低的缺点。 不容易产生漏检：可对所有23对染色体进行检测。FISH技术由于每一轮杂交的探针数目是有限的，无法对所有23对染色体进行检测，容易产生漏检。 自动化程度高：测序数据通过SOAP比对，SegSeq软件进行分析,我们前期已建立了FISH、SNP芯片技术检测染色体异常，并与华大合作建立了单细胞水平的全基因组测序。 2012年8月诞生了世界首例由NGS-PGD助孕的健康女婴。,我中心完成的NGS-PGD/PGS工作,三、单基因病PGD,ESHRE PGD工作组对扩增基础的PGD的 最佳实践指南,单基因病PGD的流程,1. 预备实验 1.1 基因诊断 1.2 设计个性化方案 1.3 构建单体型 1.4 基因组水平实验 1.5 淋巴细胞/废弃胚胎细胞水平实验 2. 临床实验 2.1 临床前预备实验 2.2 临床诊断 3. 产前诊断,1、等位基因脱扣（allele dropout, ADO） 影响PGD准确性的主要因素之一，其发生率约为5-20%。可导致胚胎的误诊。导致ADO的原因目前仍未充分弄清。 解决办法： 采用多重PCR的方法，加入标记位点的检测； 控制扩增片段大小(350bp)以及合适的引物设计； 采用荧光PCR； 提高变性温度至96，选用合适的聚合酶； 增加活检细胞数等。,单基因病PGD中，着重解决等位基因脱扣和污染两大问题,2、污染 导致PGD诊断失败和误诊的另一重要因素。污染主要来自透明带上残留的精细胞和母源的丘细胞以及前次试验扩增的DNA残留物,我们的解决办法： 1）采用ICSI防止精细胞污染； 2）防止丘细胞污染： A.操作中尽量去除卵细胞周围的丘细胞。 B.活检的卵裂球在无污染的PBS或培养基中反复洗脱。 C.采用多重PCR同时检测活检标本及双亲的DNA指纹加以鉴别。 3)防止外源DNA污染 A.实验室物理分区；所有的试剂分装，不反复冻融，耗材一次性使用。 B.设立空白对照。 C.在专用层流室中操作（如右图）。,育龄夫妇未采用任何避孕措施，1年或1年以上未能受孕，称为不孕症；虽有过妊娠，但均已流产或死胎，而未能获得活婴者，称为不育症。 中国不孕不育人数大约5000万,不孕不育的发生率1215 我们的研究发现，人类早期自然流产胚胎中超过50%发生了非整倍体异常。,植入前遗传学筛查背景-不孕症和不育症,世界范围内不孕不育率高达15%，成为继癌症和心脑血管疾病之外，严重影响人类健康的第三大疾病。,Tan YQ,et al.Genetic changes in human fetuses from spontaneous abortion after in vitro fertilization detected by comparative genomic hybridization.Biol Reprod. 2004 Feb;70(2):495-9. Epub 2003 Oct 15.,第三部分 植入前遗传学筛查的临床应用,New England Journal of Medicine 351(19):1927-1929， 2004,植入前遗传学筛查背景-年龄与生育关系,文献统计随着女性年龄的升高，流产率逐渐升高，生育率急剧下降。,我中心2012年-2013年间不同年龄阶段的296对夫妇共1016枚检测胚胎异常率统计，新发生染色体异常率随女方年龄的增长而升高。,植入前遗传学筛查背景-染色体异常与胚胎发育,染色体异常是引起胚胎发育能力降低的重要原因，也是出生缺陷的重要原因。 据报道，体外培养的D3分裂期卵裂球有50%-70%概率出现染色体异常，其出现频率随母方年龄增加而增加。即使发育到D5囊胚期，仍有40%概率出现染色体异常。 传统的胚胎形态学评价体系不能反映胚胎的遗传学真实情况。据报道，在形态学良好的胚胎中，仅42%的胚胎是染色体完全正常的。,植入前遗传学筛查的概念,PGS (Preimplantation Genetic Screening) 指对在胚胎发育中散在发生的染色体非整倍体异常进行筛查，以帮助筛选染色体水平上最佳胚胎，理论上可以提高试管婴儿的着床率和活产率。 PGS 适应征：针对高龄女性、反复植入失败者，曾有染色体异常儿妊娠史、反复自然流产、严重男性因素不育等 早期PGS应用的技术：荧光原位杂交(FISH),Joyce Harper, et al 2011,FISH技术的改进,增加FISH探针的颜色以及数量(为了易于区分避免色差，至多可选择5色同时杂交)。 增加杂交次数：对细胞核信号洗脱后重复杂交(一个细胞核最多可承受三次洗脱重杂交) 进行双卵裂球活检？,代表性文章,1994 Grifn DK, et al.Clinical experience with preimplantation diagnosis of sex by dual uorescent in situ hybridisation. J Ass Reprod Genet 11,132143.(首次使用双重杂交) 2006 Weier JF,et alMolecular cytogenetic studies towards the full karyotype analysis of human blastocysts and cytotrophoblasts.Cytogenet Genome Res. 2006;114(3-4):302-11(对24色FISH的尝试) 2009 Colls P, et al.Increased efficiency of preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy by testing 12 chromosomes.Reprod Biomed Online, 19(4):532-538.(首次用到FISH-PGD检测12条染色体),以FISH技术和第三天活检为基础的PGS -并未显示能提高分娩率,卵裂期使用FISH技术的随机对照试验检测了不同数目的染色体： Staessen et al , 2008 Meyer et al, 2009 Mersereau et al, 2008 Blockeel et al, 2008 Debrock et al, 2010 Hardarson et al, 2008 Schoolcraft et al, 2009 没有一个实验显示能增加分娩率，甚至部分研究显示分娩率显著下降。,1.仅能检测少数染色体(至多12条)； 2.商业检测探针多位于染色体亚端粒区(长短臂末端)，不能定位染色体断裂位点； 3.信号强度易受到固定效果、探针灵敏度、背景干扰以及杂交程度等的影响； 文献报道FISH误诊率约710%。,可能的原因？,分裂期卵裂球高度的染色体异常嵌合，导致检测细胞不能很好代表整个胚胎；,卵裂期活检过程本身可能对胚胎发育潜能产生危害和负面影响,选择合适的活检时间,全染色体筛查的方法,更多RCTs研究,更为有效的PGS技术,卵裂期活检 -损伤胚胎发育潜能的风险,- Tan YQ., et al. Hum Rerpod. 2013;28(9):2581-2592,D3活检影响囊胚发育,卵裂期活检 -损伤胚胎发育潜能的风险,所有患者同时移植两枚胚胎，一枚来自卵裂期或囊胚期活检的胚胎，一枚来自未活检的胚胎，采用DNA指纹鉴定妊娠胚胎的来源。 2013,卵裂期活检 -损伤胚胎发育潜能的风险,囊胚期活检较卵裂期活检对胚胎的发育潜能影响更小；,卵裂期活检 -损伤胚胎发育潜能的风险,嵌合对PGS诊断的影响,胚胎染色体嵌合现象 的概率在25-80%之 间，概率范围大是由 于各研究使用胚胎来 源、胚胎发育阶段及 染色体检测方法的差 异。,胚胎嵌合现象示意图,In 1993 chromosomal mosaicism was described in human preimplantation embryos for the first time. -Delhanty et al.1993,早期胚胎染色体嵌合的发生率,conclusions: Diploidaneuploid mosaicism is by far the most common chromosomal constitution in spare human preimplantation embryos after IVF. This undermines the reliable determination of the ploidy status of a cleavage-stage embryo based on the analysis of a single cell. Future research should determine the origin and developmental potential of mosaic embryos,只有9的胚胎有完全正常的卵裂球 - Nat Med 2009,随着胚胎的发育，嵌合体胚胎比例逐渐降低。,The fate of the mosaic embryo chromosomal constitution and development of Day 4, 5 and 8 human embryos. Santos MA,et al. Human Reproduction, Vol.25, No.8 pp. 19161926, 2010,嵌合对PGS诊断的影响,40%aneuploid cells,25%aneuploid cells,25-40%aneuploid cells,FISH reanalysis of inner cell mass and trophectoderm samples of previously array-CGH screened blastocysts shows high accuracy of diagnosis and no major diagnostic impact of mosaicism at the blastocyst stage,Antonio C,et al. Human Reproduction, Vol.0, No.0 pp. 110, 2013,真正会影响到移植风险的嵌合胚胎发生率仅为5%. 因为绝大多数非整倍体异常在内细胞团与滋养层中共同发生。 而在滋养层细胞中可能嵌合存在更多异常。,嵌合对PGS诊断的影响,如何理解卵裂期活检的影响（Timelapse分析）,正常卵裂球的移除进一步影响胚胎发育的潜能 异常卵裂球的存在影响胚胎的正常诊断,囊胚活检有替代卵裂期活检的趋势,作者认为：卵裂球活检仍相对更加损伤胚胎，临床结局显示囊胚活检应是最为合适的植入前遗传学检测的活检时期。,Fertil Steril. 2013 Sep;100(3):608-14. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.07.004.,极体活检风险最低的活检方法,极体活检对胚胎没有损伤，随着极体染色体检测技术的进步，如更精确而且便宜的测序技术的应用，极体活检将成为未来PGD/PGS中一项非常有前景的技术。,讨论：极体活检vs囊胚活检？,避免嵌合的影响 不影响未来的胚胎 仅检测减数分裂错误而未评估有丝分裂错误，而有丝分裂可能修复减数分裂错误,能分析来自父母双方的异常 嵌合(滋养外胚层可能不能代表内细胞团) 囊胚培养和玻璃化冷冻,美国的Nathan Treff 代表与欧洲的Joep Geraedts达成了许多共识：极体活检与囊胚活检各有优势，不再建议进行卵裂期活检,Willadsen S et al. Hum. Reprod. 1999;14:470-475,早年PGS尝试：利用动物MII卵构建人卵裂球分裂相 技术难度大，构建成功率低，无法实现临床应用。,全染色体组筛查技术,全染色体组筛查技术,FISH: 9-11条chr,所有23对人染色体都需要筛查,CGH-比较基因组杂交,aCGH: 基因组杂交芯片,Microarray SNP,RealTime PCR,Next Generation Sequencing,全染色体筛查技术进展,1996 Sermon K., et al. Adaptation of the primer extension preamplification (PEP) reaction for preimplantation diagnosis: single blastomere analysis using short PEP protocols. Mol Hum Reprod. 1996; 2(3):209-212. (最早用全基因组扩增法进行PGD，但仅筛查几个基因) 1999 Wells D., et al. Detailed chromosomal and molecular genetic analysis of single cells by whole genome amplification. Nucleic Acids Res, 27:1214-1218. (首次使用单细胞mCGH做PGS) 2005 Knijnenburg J., et al. Rapid detection of genomic imbalances using micro-array consisting of pooled BACs covering all human chromosome arms. Nucleic Acids Res. 2005;12(33):e159. (首次用aCGH做PGS) 2007 Treff NR., et al. Accurate 23 chromosome aneuploidy screening in human blastomeres using single nucleotide polymorphism (SNP) microarray. Fertil Steril, 2007;86:s217. (首次用SNParray做PGS) 2013 Eric J. Forman, et al.Comprehensive chromosome screening alters traditional morphology-based embryo selection:a prospective study of 100 consecutive cycles of planned fresh euploid blastocy